[发明专利]鉴定根肿病菌4号生理小种的特异基因、特异性引物、含有所述引物的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供基因PBRA003268在检测根肿病菌4号生理小种中的应用，所述基因的序列如SEQ No.1所示。本发明还提供根肿病菌4号生理小种的检测方法，包括以待测样品的DNA为模板，用特异引物进行PCR扩增；通过扩增产物判断检测样品是否含有根肿病菌4号生理小种。本发明还提供检测根肿病菌4号生理小种的基因类型的特异基因及方法。本发明的检测方法可以直接对感病植物组织总DNA进行PCR鉴定，具有操作简化、所需材料少的特点，能够适用于不同地区、不同侵染时期的植物组织的根肿菌生理小种鉴定，还实现了区分4号生理小种的不同基因类型的快速检测，通过应用于田间动态变化监测，为抗病品种的合理布局提供指导依据。

【技术领域】

本发明涉及分子生物学领域。具体涉及用于检测根肿病菌4号生理小种的特异基因和用于检测根肿病菌4号生理小种基因类型的特异基因及其应用。

【背景技术】

根肿病是制约十字花科作物生产的一种世界性病害。它由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)引起，主要危害植株的根部，使其根部细胞发生畸形变化，挤压维管束，影响对水分和养分的吸收，从而使植株地上部分萎蔫或死亡，严重影响十字花科作物产量。其寄主范围包括十字花科330个属，3700 个种的植物。目前世界范围内已经有80个国家或地区报道有根肿病发生，在我国28个省均有分布，特别在西南，东北和华中地区尤为严重，并呈现加速蔓延的态势，造成极大危害。

由于根肿菌在土壤中存活时间长，传统农业防治很难奏效，化学防治易对环境造成污染，栽培抗病品种则是一种较为有效的防治手段，是从根本上解决根肿病危害的途径。但由于根肿菌存在明显的小种分化，所推广的抗病品种必须结合当地生理小种种类及组成；此外，在抗病品种的应用中，由于病原菌与宿主的相互作用，相互选择，使得一些本来抗病的品种经多年种植，抗性也会减弱甚至丧失。因此，根肿菌生理小种的鉴定以及田间变化的动态监测是根肿病抗病品种合理应用的基础。

根肿菌生理小种鉴定一直以来都是依据病原菌与鉴别寄主之间的互作结果，通过症状进行判别，其中Williams鉴别系统(4个鉴别寄主)和ECD(Europeanclubrootdifferentialhost)鉴别系统(15个鉴别寄主)应用最为广泛。当前，已有许多科研工作者利用这两种体系对世界范围内各个地区的小种进行鉴定。2008 年，沈向群首次用Williams鉴别系统对吉林、辽宁、四川和山东这四个省大白菜产区的15个菌系，丁云花(2013)对云南，重庆，湖北，山东，陕西，四川，上海，辽宁18个菌系进行鉴定，均表明中国目前的优势生理小种为4号。近年湖北，湖南，东北，安徽，西藏，云南也陆续对各个省进行了较为细致的小种鉴定(卢桂香etal.2013；彭沙莎etal.2013；赵杨etal.2013；方春华etal.2014；刘峰etal.2013)，各省的鉴定结果(除了湖南)都指出4号小种为我国的优势小种。

但这两种鉴别系统亦存在缺陷，例如利用鉴别寄主鉴定生理小种费时费力；结果易受根肿菌休眠孢子成熟程度和活力的影响；症状的形成需要较长时间，在此期间，根肿菌的侵染和扩展易受温度和湿度等环境因素的影响；田间根肿样品多为复合群体，也会影响与鉴别寄主之间互作的结果。基于此，建立对根肿菌生理小种鉴定的一种准确、方便、快速的分子方法，尤其是优势小种4号的鉴定，对我国根肿病的防治具有重要意义。据报道，目前仅发现基因Cr811可以将5号与3号和8号生理小种区分(Zhangetal.2015)，一个RAPD分子标记存在于1号生理小种(Soméetal.1996)。但用于根肿菌生理小种分子鉴定的特异基因极少，其分子鉴别体系极不完善，针对4号生理小种的分子鉴定目前还未有报道。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术对于根肿病菌(P.brassicae)生理小种4号难以鉴别、现有技术的鉴定方法中存在周期长且结果易受环境因素影响、鉴别寄主不易扩繁等问题，提供了根肿病菌生理小种4号的分子鉴定方法，并将其应用于根肿病菌4号生理小种，从而建立一种高效、快速、准确判断根肿菌4号生理小种的鉴定方法。