[发明专利]基于FRET效应探测细胞凋亡过程的方法

说明书

本发明提供一种基于FRET效应来探测细胞凋亡过程的方法，其主要步骤是：制备具有长寿命的磷光铱配合物作为给体D，制备短寿命有机荧光小分子化合物作为受体A，D和A两者之间存在FRET效应；通过生物正交反应，将给体D和受体A分别连接到能够被仅存在于细胞凋亡过程中的caspase酶剪切的肽链的两端，构成D‑A型探针，所述D‑A型探针可以在细胞外组装构成然后植入到细胞内部，也可以直接在细胞内组装；利用共聚焦成像或寿命成像技术，检测D‑A型探针当中给体D或受体A的寿命变化，从而判断细胞的凋亡进程。本发明可应用于细胞凋亡各个阶段，能够分辨细胞凋亡的各个时期，在细胞成像、生物标记和传感领域等方面具有非常重要的应用前景。

技术领域

本发明属于有机光电材料技术领域，具体涉及一类基于FRET效应的可用于细胞凋亡检测的D-A型探针，及其在细胞凋亡过程中的探测应用。

背景技术

细胞凋亡亦称为细胞程序性死亡，是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡现象，它在引导胚胎的形成、维持正常细胞的平衡、调节生物体的生长发育和自然衰老等方面，扮演着非常重要的角色，其具体途径以及凋亡过程中涉及的复杂细节，至今尚未完全了解。因此，探索不同的方法来研究细胞凋亡过程及其具体细节，其意义十分重大。

现有技术当中，对于凋亡细胞的检测主要是应用凝胶电泳技术和流式细胞术，根据细胞凋亡时的分子变化进而判定细胞是否凋亡。尽管这些技术提供了有用的信息，但它们是基于凋亡终点的分析，不能直接并实时观察凋亡过程。目前，对细胞凋亡过程的检测，主要是利用荧光成像技术对凋亡细胞过程中的典型性特征进行检测，如：凋亡早期细胞表面出现的磷脂酰丝氨酸(PS)和线粒体膜电位的变化，凋亡晚期出现染色质断裂，等等。这类技术需要通过多种结果来判定细胞凋亡，无法通过单一的探针对细胞凋亡的各个阶段进行检测，存在着检测假阳性的可能性。

另一方面，荧光成像技术虽然优点突出，但是其缺点也无法避免，比如：探针荧光(或磷光)的强度强烈依赖于浓度，受生物背景荧光干扰强，在短时间内易于光漂白，荧光探针的发射带倾向于重叠，限制了多种探针的同时使用，等等。然而，荧光(或磷光)寿命是荧光物质的固有性质，与浓度、光漂白和激发强度无关，与荧光成像相比，荧光寿命成像技术具有荧光寿命区间范围广、分辨率高、受背景荧光干扰小、重叠范围小、可同时使用等优点，已逐渐成为细胞生物学中有影响力的检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于FRET效应来探测细胞凋亡过程的方法，旨在更有效、更直接地探测细胞凋亡过程。

本发明的技术解决方案是：基于FRET效应探测细胞凋亡过程的方法，包括以下步骤：

S1，制备具有长寿命的磷光铱配合物作为给体D：首先制备得到可以同叠氮发生生物正交反应的产物，然后将其与对硝基苯基氯甲酸酯连接，再与含有氨基的物质反应生成辅助配体，辅助配体再与铱二氯桥通过配位反应制备得到磷光铱配合物。

S2，制备有机荧光小分子化合物作为受体A，受体A的寿命比给体D短，两者之间存在FRET效应；首先制备得到可以同降冰片烯发生生物正交反应的产物，然后通过缩合反应将其连接到含有羧基的短寿命的有机荧光小分子化合物上。

S3，通过生物正交反应，将给体D和受体A分别连接到肽链的两端构成D-A型探针，所述肽链是能够被仅存在于细胞凋亡过程中的caspase酶剪切的肽链，所述D-A型探针可以在细胞外组装构成然后植入到细胞内部，也可以直接在细胞内组装；

S4，利用共聚焦成像或寿命成像技术，检测D-A型探针当中给体D的寿命变化，判断细胞的凋亡进程；或检测D-A型探针当中受体A的寿命变化，判断细胞的凋亡进程。