[发明专利]一种制备谷胱甘肽合成酶系的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种从微生物细胞中制备谷胱甘肽合成酶系的方法。该谷胱甘肽合成酶系的制备方法包括：(1)将产谷胱甘肽合成酶系的微生物培养、离心收集细胞、细胞破碎；(2)配制聚丙二醇/乳酸钠双水相萃取体系溶液；(3)利用双水相萃取体系进行谷胱甘肽合成酶系的分离和纯化，得到含有谷胱甘肽合成酶系的乳酸钠溶液；(4)采用超滤膜过滤浓缩，截留液冷冻干燥，制得谷胱甘肽合成酶系产品。本发明的聚丙二醇/乳酸钠双水相体系对酶活性具有保护作用，特别适合谷胱甘肽合成酶系的分离纯化；本发明可以实现谷胱甘肽合成酶系制备的连续化、规模化，并且酶活力回收率高、纯度高，生产工艺简便，谷胱甘肽合成酶系的生产成本较低。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种从微生物细胞中制备谷胱甘肽合成酶系的方法。

背景技术

谷胱甘肽合成酶系由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶组成，该酶系催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽。谷胱甘肽具有清除自由基、解毒、延缓衰老、预防糖尿病、保护肝脏、抗辐射、提高人体免疫力、抑制艾滋病病毒、防止皮肤老化等功能，在临床医学、运动营养学、食品加工等众多领域具有重要的应用价值和产业前景，其工业化生产越来越受到重视.

酶法生产谷胱甘肽具有工艺明确，底物转化率高，产品纯度高等优点，已引起了人们的广泛关注。谷胱甘肽合成酶系的制备主要采用微生物发酵法，即通过培养具有高活性谷胱甘肽合成酶系的微生物如酵母或大肠杆菌等获得，不同来源的微生物γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的性质、分子结构和相对分子量均不相同，如大肠杆菌E.coli B的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶相对分子量为55kDa，谷胱甘肽合成酶由4个亚基组成，相对分子量为152kDa。谷胱甘肽合成酶系的制备过程包括微生物培养和酶的分离纯化。在酶的生产成本构成中，分离纯化等工序的成本占有相当大的比例，因此，如何采用高效的分离技术是谷胱甘肽合成酶系生产中需要解决的技术问题。

目前，谷胱甘肽合成酶系的分离纯化方法主要有盐析法、离心法、离子交换法等，如田慧等(生物技术通报，2016年11期)在进行谷胱甘肽合成酶系制备研究时，采用60％饱和度硫酸铵沉淀，酶活回收率为93％。上述方法存在酶活力回收率低、纯度低、生产周期较长、不能连续生产等问题，从而导致谷胱甘肽合成酶系的生产成本较高。因此，改进现有生产技术以及开发新的生产技术以降低谷胱甘肽合成酶系的生产成本势在必行。

乳酸钠能与水混溶，常用作水分保持剂、酸度调节剂、抗氧化剂、稳定剂等。研究发现，聚丙二醇和乳酸钠两种物质在一定条件下能够形成一种目前文献中尚未见报道的双水相体系，该体系对酶活性具有保护作用。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种酶活力回收率高、生产成本低、便于规模化生产的谷胱甘肽合成酶系的制备方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种制备谷胱甘肽合成酶系的方法，包括以下步骤：

(1)将产谷胱甘肽合成酶系的微生物培养，得细胞培养液，离心，制得菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量百分比浓度为25～35wt％的溶液，破碎细胞，得到细胞破碎液；

(2)在20～30℃下配制乳酸钠水溶液，将聚丙二醇加入到乳酸钠溶液中，在总体系中使聚丙二醇的质量百分比浓度为20～30wt％、乳酸钠的质量百分比浓度为15～25wt％，混合均匀，制得聚丙二醇/乳酸钠双水相体系溶液；

(3)将步骤(1)制得的细胞破碎液与步骤(2)制得的聚丙二醇/乳酸钠双水相体系溶液按体积比(1～2)：1混合均匀，静置分相，制得乳酸钠下相溶液和含有谷胱甘肽合成酶系的聚丙二醇上相溶液；

(4)向步骤(3)制得的聚丙二醇上相溶液中加入乳酸钠，使乳酸钠在总体系中的质量浓度为8～12wt％，混合均匀，静置分相，制得乳酸钠下相溶液和含有谷胱甘肽合成酶系的聚丙二醇上相溶液；