[发明专利]一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法

说明书

本发明公开了一种制备猪源长效干扰素λ3的方法和应用，属于基因工程产品制备领域。包括编码猪源长效干扰素λ3基因的克隆，含猪源干扰素λ3基因和长效元件用不同Linker连接的真核表达载体的构建，用所述含不同Linker的猪源干扰素长效λ3基因的重组真核表达载体转化GS115，PCR扩增筛选阳性克隆子，接种阳性克隆子于含0.02%生物素的BMGY培养基，28℃200 rpm培养48小时后离心，弃去上清后用等体积含0.02%生物素的BMMY培养基重悬，并加入1%28℃200 rpm甲醇诱导培养，每隔24 h加入终浓度1%甲醇，培养96 h后取上清，制备不同连接Linker的蛋白表达。所述制备的猪源长效干扰素λ3具有更长的半衰期，较报道的普通干扰素λ3半衰期（4 h以内）提高10倍以上。

技术领域：

本发明属于基因工程产品制备领域，具体涉及一种制备猪源长效干扰素-λ3（ABD- IFNλ3） 蛋白的方法和应用。 背景技术：

干扰素（interferon， IFN）是一种广谱抗病毒剂，包括I型干扰素（IFNα、IFNβ）、II型干扰素（IFNγ等）、III型干扰素（IFNλs，包括IFNλ1、IFNλ2、IFNλ3），其并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。目前，国内外学者III型 IFN 生物学功能和抗病毒作用已经进行了深入的研究^[3-5]，结果表明，相比于I型和II型干扰素，III型干扰素IFNλ3可以有效的缓解仔猪腹泻的症状，降低病猪的死亡率。前期研究表明，原核表达III型猪干扰素均为包涵体形式，需要通过包涵体变性、复性的方法来制备IFNλ3，操作复杂且成本较高^[4,6]。采用酵母分泌表达的方式可获得可溶的，表达量的IFNλ3蛋白，但是干扰素半衰期短容易降解，目前已有研究的长效元件ABD能有效提高干扰素半衰期，延长干扰素作用时间^[2]。

由于干扰素表达过程中易发生断裂，因此用不同连接Linker将长效元件ABD与IFNλ3连接，能获得不影响表达量且蛋白断裂明显较少的表达菌株。

参考文献：

[1]Albumin Fusion of Interleukin-28B: Production andCharacterization ofIts Biological Activities and Protein Stability.（PLOS ONE，2013）

[2] Anti-serum albumin domain antibodies in the development of highlypotent, efficacious and long-acting interferon.（Protein Engineering, Design &Selection，2010）

[3] IFN-lambda preferably inhibits PEDV infection of porcine intestinal

epithelial cells compared with IFN-alpha.（Antiviral Research，2017）

[4] 猪Ⅲ型干扰素IFNλ1的克隆、表达和抗病毒活性研究。(华中农业大学硕士学位论文 ，2017）

[5]Short communication: antiviral activity of porcine IFN-λ3 againstporcine epidemic diarrhea virus in vitro.（Virus Genes，2016）

[6]长效干扰素研究进展。(中国生物工程杂志,2010）

发明内容：