[发明专利]抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法及其应用在审
| 申请号： | 201611180957.4 | 申请日： | 2016-12-20 |
| 公开（公告）号： | CN108203716A | 公开（公告）日： | 2018-06-26 |
| 发明（设计）人： | 包晟;谢亦武;曹天福;包世啟 | 申请（专利权）人： | 深圳市雅臣爱己生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/13;C07K16/46;C07K16/08;A61K39/42;A61P31/22;A23K50/30;A23K20/147 |
| 代理公司： | 深圳市顺天达专利商标代理有限公司 44217 | 代理人： | 郭伟刚 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市龙*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明涉及基因工程重组抗猪伪狂犬病毒猪源化单抗制备及其应用，具体涉及抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法及其应用；本发明筛选各种能稳定分泌抗伪狂犬病毒(PRV)糖蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，分泌单克隆抗体，扩大培养后富集、纯化、测序，设计相应的特异性引物，将其猪源化，以病毒类基因载体或非病毒基因载体(包括质粒DNA、微环DNA等)进行克隆，将不同的猪源化单抗采用昆虫细胞或CHO细胞发酵大规模生产猪源化单抗蛋白，或者直接将上述含猪源化单抗基因载体输入猪只。通过给猪注射或饲喂猪以及滴鼻和喷雾等方式，采用这种抗伪狂犬病毒猪源化单抗中和伪狂犬病毒，以被动免疫方式净化伪狂犬病阳性猪场以及预防和治疗猪伪狂犬病。 | ||
| 搜索关键词： | 猪源 单抗 伪狂犬病毒 制备 基因载体 非病毒基因载体 分泌单克隆抗体 阳性杂交瘤细胞 应用 基因工程重组 猪伪狂犬病毒 单克隆抗体 特异性引物 猪伪狂犬病 被动免疫 昆虫细胞 扩大培养 伪狂犬病 质粒DNA 糖蛋白 测序 滴鼻 分泌 富集 喷雾 饲喂 微环 发酵 蛋白 克隆 中和 注射 病毒 筛选 净化 治疗 预防 | ||
【主权项】：
1.抗伪狂犬病毒猪源化单抗制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S100、制备杂交瘤细胞：将抗伪狂犬病毒经过小鼠免疫和细胞融合，制得可分泌抗伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞；S200、可变区序列与恒定区序列的克隆：提取所述杂交瘤细胞的总RNA，反转录制备cDNA，分别扩增鼠源抗体可变区的轻链、重链的序列；取淋巴细胞提取其总RNA，反转录制备cDNA，分别扩增猪源抗体恒定区轻链、重链序列；S300、轻链与重链全长基因的克隆：重叠延伸所述鼠源抗体可变区轻链和所述猪源抗体恒定区轻链，获得鼠‑猪嵌合轻链全长基因序列；重叠延伸所述鼠源抗体可变区重链和所述猪源抗体恒定区重链，获得鼠‑猪嵌合重链全长基因序列；S400、制备抗伪狂犬病毒猪源化单抗：将所述鼠‑猪嵌合轻链全长基因序列和所述鼠‑猪嵌合重链全长基因序列克隆于基因载体，扩增后纯化获得基因型抗伪狂犬病毒猪源化单抗；或者，将所述鼠‑猪嵌合轻链全长基因序列和所述鼠‑猪嵌合重链全长基因序列克隆于表达载体并在表达系统中表达，获得蛋白型抗伪狂犬病毒猪源化单抗。
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- 彭大新;查夕馨;陈素娟;秦涛 - 扬州大学
- 2019-06-18 - 2019-10-08 - C12N15/85
- 本发明涉及动物疫苗技术领域，尤其涉及转染293T和DF‑1共培养细胞的H9N2亚型冷适应减毒活疫苗的拯救方法。选择一株H9N2亚型冷适应减毒株TX‑25‑CE30，构建表达其基因的8个质粒，以TX‑25‑CE30内部基因为骨架，以其母本毒株TX株HA、NA基因为外部基因，转染人胚肾细胞293T与鸡成纤维细胞系DF‑1共培养细胞，拯救出对哺乳动物细胞感染能力较弱的毒株，命名为rTXca‑HA‑NA，该重组病毒免疫鸡后对同源毒株的一次免疫保护率可达100％。
- 外源基因定点整合至GAPDH基因下游的打靶载体构建方法及其应用-201910559340.0
- 阮进学;韩晓松;赵书红;熊友才;庄荣志;赵长志;余梅;李新云;李长春;谢胜松;付亮亮;赵云霞 - 华中农业大学
- 2019-06-25 - 2019-10-08 - C12N15/85
- 本发明公开了一种将外源基因定点整合至猪GAPDH基因下游的打靶载体，所述打靶载体是以GAPDH基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上。将该打靶载体与含特异性靶向猪GAPDH基因下游的sgRNA的CRISPR/Cas9切割载体共转染猪真核细胞中，可以将外源基因定点整合至GAPDH基因下游。本发明提供的这一打靶位点，可以拓宽外源基因在猪基因组中整合位点的范围，为制备外源基因在猪基因组中高效稳定的表达奠定基础。
- 一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法-201910575181.3
- 高凤山 - 大连大学
- 2019-06-28 - 2019-10-08 - C12N15/85
- 一种稳定表达VP1融合EGFP的单克隆细胞株的制备方法，属于疫苗技术领域。本发明解决技术问题的技术方案包括以下步骤：培养细胞PK15、G418的适用浓度应为500μg/mL、将LipofectamineTM2000与pEGFP‑N1‑VP1质粒以1:1的比例转染至PK15细胞、G418筛选、弱酸洗脱得到SLA‑I类呈递肽。
- 专利分类
