[发明专利]一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途，该适体探针包括适体序列，适体序列与肿瘤标志物Ⅰ特异性识别并紧密结合，适体探针的5’端和3’端互补杂交，使其形成发夹结构，发夹结构的茎干部分包括肿瘤标志物Ⅱ的识别序列，且包括限制性内切酶的识别位点。本发明的电化学生物传感器，将适体探针固定在工作电极表面制备得到。本发明可以实现凝血酶和M.Sss I DNA甲基化转移酶多个肿瘤标志物分子的平行分析。本发明的传感器检测灵敏度高，对凝血酶的检测下限为0.1ng/mL，对M.Sss I DNA甲基化转移酶的检测下限为0.04U/mL。

技术领域

本发明涉及分析化学领域，特别是指一种检测两种肿瘤标志物的适体探针、电化学生物传感器及其制备方法和用途，可用于肿瘤等重大疾病标志物的分析检测。

背景技术

临床上对恶性肿瘤进行快速灵敏筛查常以肿瘤标志物作为检测指标。肿瘤标志物是一类由肿瘤组织和细胞产生的与肿瘤形成、发生相关的物质，主要是肿瘤抗原、激素、酶及其同工酶等。例如凝血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，具有催化纤维蛋白元变成纤维蛋白，促进血液凝固和调控凝血等作用，在解释肿瘤的发生机制及作为早期诊断、疗效及预后判断等方面均具有重要意义。此外，DNA甲基化转移酶可以催化DNA甲基化，在基因表达的调节中起着重要作用，异常的的DNA甲基化转移酶活性将导致异常的DNA甲基化，这些异常的甲基化与癌症等许多疾病密切相关。因此，DNA甲基化转移酶也可作为癌症预测和治疗监控的重要标志物。发展可以高灵敏检测这些肿瘤标志物蛋白质和DNA甲基化转移酶的电化学生物传感器是恶性肿瘤早期诊断的一个非常有效的方法。

近年来，核酸适体技术的发展为肿瘤标志物蛋白质的检测提供了新的契机。核酸适体是通过配体指数富集系统进化技术在体外筛选得到的单链DNA或RNA寡核苷酸片段[HoH A,Leclerc M.J.Am.Chem.Soc.,2004,126(5):1384～1387]。它们有着特殊的三维结构，可以和蛋白质，小分子甚至细胞高特异性结合。核酸适体作为一种新型分子识别元件，由于其具有独特的优势如适体合成简单，特异性强，稳定性好，容易标记和修饰等而被广泛地应用于蛋白质分析，药物选择，疾病诊断，电化学生物传感器和分子识别元件的设计等方面。文献已经报道了一系列利用核酸适体检测蛋白质的技术和方法，如比色法[Alsager O A,Kumar S,Zhu B C,Travas-Sejdic J,McNatty K P,Hodgkiss J M.Anal.Chem.,2015,87(8):4201～4209]，荧光法[Yang C,Spinelli N,Perrier S,Defrancq E,PeyrinE.Anal.Chem.,2015,87(6):3139～3143]，电化学法[Zhang S B,Hu X,Yang X H,Sun Q L,Xu X L,Liu X W,Shen G Y,Lu J L,Shen G L,Yu R Q.Biosens.Bioelectron.,2015,66:363～369]等等。其中，电化学适体传感器由于其灵敏度高、检测时间短、样品用量少、前处理简单、不受样品浊度影响、所用仪器便宜、易于微型化和自动化等特点而备受关注。

限制性核酸内切酶是可以识别DNA特异序列，并在识别位点切割双链DNA的一类内切酶。例如EcoR I限制性核酸内切酶的特异性识别位点为GAATTC互文结构，Sal I限制性核酸内切酶的特异性识别位点为GTCGAC互文结构，Hpa II限制性核酸内切酶的特异性识别位点为CCGG互文结构。限制性核酸内切酶常用于DNA基因组物理图谱的组建，基因的定位和基因分离，DNA碱基序列分析等，在电化学生物传感器方面应用较少。

现有电化学适体传感器绝大部分都是基于核酸适体与目标分子反应后发生构型转换从而引起电信号的变化而构建的。基于该原理的电化学适体传感器无论是signal-on型或signal-off型往往都存在一定的背景电流问题，这都会在一定程度上影响传感器的分析性能。

发明内容