[发明专利]一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法

说明书

本发明公开了一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。该方法包括：采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，然后置于MS固体培养基上25±2℃暗培养2天；然后转至筛选培养基上，于25℃暗培养，每隔15～20天继代一次，直至获得灯盏细辛毛状根；进行鉴定。本发明首次以绿色荧光蛋白(GFP)作为目的基因，为进一步利用绿色荧光蛋白基因作为构建药用成分生物合成途径的报告基因提供一定的参考依据，实现了该基因在灯盏细辛毛状根遗传转化体系的高效表达，同时对外源基因在灯盏细辛毛状根生物反应器中的高效表达的可行性研究奠定基础。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。

背景技术

灯盏细辛又名灯盏花，为菊科植物短葶飞蓬(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.)的干燥全草。主要分布于云南、四川、贵州、广西等地。具有活血化瘀、通络止痛，祛风散寒等功效。我国对灯盏细辛化学成分的研究始于20世纪70年代中期，目前已分离鉴定出黄酮类、咖啡酰类、酚酸类、吡喃酮类、植物甾醇、倍半萜类等多种类型的化学成分，其中以灯盏甲素和灯盏乙素为代表的黄酮类化合物是其活性成分。其注射液制剂在临床上主要用于治疗心脑血管系统疾病，除此之外，对治疗老年性疾病、颈性眩晕、糖尿病、肾病等疾病也具有很好的效果。

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是1962年由Shimomura O等首次从多管水母属(Aequoreavictoria)中分离纯化出的一种具有独特功能的生物发光蛋白。能够通过催化自身65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化形成稳定的生色团，在蓝光或紫外光激发下产生的绿色荧光，GFP作为一种标记蛋白具有发光稳定、耐受性良好、检测方便、可进行活体观察、对受体细胞基本无毒和损伤作用等优点，已成为监测外源基因在遗传转化体系中表达情况的有效工具。

目前，针对灯盏细辛的相关研究主要集中在有效成分的提取分离、药效和药理等方面，偶见灯盏细辛遗传转化体系研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，为进一步提升灯盏细辛药用成分含量以及探究在灯盏细辛毛状根遗传转化体系中外源基因的高效表达奠定基础。

第一方面，本发明要求保护一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法。

本发明所提供的灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，具体可包括如下步骤：

(a1)采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，将侵染后的灯盏细辛叶盘置于MS固体培养基上，于25±2℃(如25℃)恒温暗培养2天。

其中，所述侵染液为用重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌至OD₆₀₀值为0.6所得；所述重悬液为含有终浓度为100μmol·L^-1乙酰丁香酮的MS液体培养基。

所述MS固体培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：

大量元素：NH₄NO₃ 1650mg·L^-1、KNO₃1900mg·L^-1、CaCl₂·2H₂O 440mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1、KH₂PO₄ 170mg·L^-1；