[发明专利]一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法

权利要求书

1.一种灯盏细辛遗传转化诱导毛状根的方法，包括如下步骤：

(a1)采用含有目的基因表达载体的发根农杆菌的侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘，将侵染后的灯盏细辛叶盘置于MS固体培养基上，于25±2℃恒温暗培养2天；

所述侵染液为用重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌所得；所述重悬液为含有终浓度为100μmol·L^-1乙酰丁香酮的MS液体培养基；

(a2)将步骤(a1)培养后的灯盏细辛叶盘转至筛选培养基上，于25℃暗培养，每隔15～20天继代一次，共进行两次以上继代，直至获得灯盏细辛毛状根；

进行所述继代时采用的继代培养基与所述筛选培养基均为含有抗生素的1/2MS固体培养基；所述抗生素为抗生素1和抗生素2，所述抗生素1为所述目的基因表达载体上携带的抗性筛选标记所对应的抗生素，所述抗生素2为能够抑制所述发根农杆菌生长的抗生素；

所述继代培养基中的所述抗生素2的含量少于所述筛选培养基中所述抗生素2的含量，且进行后一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量均少于进行前一次继代时采用的所述继代培养基中的所述抗生素2的含量；

(a3)对步骤(a2)所得灯盏细辛毛状根进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，采用所述侵染液侵染灯盏细辛无菌叶盘前，不包括将所述灯盏细辛无菌叶盘进行预培养的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所述侵染液是按照包括如下步骤的方法制备得到的：向OD₆₀₀值为0.4的所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌的培养液中加入终浓度为100μmol·L^-1的乙酰丁香酮，继续培养至菌液OD₆₀₀值为0.6，离心后弃上清液，用所述重悬液重悬所述含有目的基因表达载体的发根农杆菌，即得所述侵染液。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所述灯盏细辛无菌叶盘为0.4～0.6cm²大小的叶盘。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，采用所述侵染液侵染所述灯盏细辛无菌叶盘是按照包括如下步骤的方法进行的：将所述灯盏细辛无菌叶盘置于所述侵染液中，28℃ 100r·min^-1振荡10min。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，所述发根农杆菌为农杆菌C58C1。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a2)中，所述抗生素2为头孢噻污钠；和/或

所述抗生素1为潮霉素B。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述筛选培养基是在1/2MS固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素B后得到的培养基；所述筛选培养基中头孢噻污钠的终浓度为500mg·mL^-1、潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL^-1；

和/或

步骤(a2)中共进行了三次继代；

进行第一次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2MS固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素B后得到的培养基；所述继代培养基中头孢噻污钠的终浓度为300mg·mL^-1、潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL^-1；

进行第二次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2MS固体培养基中加入头孢噻污钠、潮霉素B后得到的培养基；所述继代培养基中头孢噻污钠的终浓度为100mg·mL^-1、潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL^-1；

进行第三次继代时，所采用的所述继代培养基是在1/2MS固体培养基中加入潮霉素B后得到的培养基；所述继代培养基中潮霉素B的终浓度为2.5mg·mL^-1。