[发明专利]一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用

说明书

本发明公开了一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用。所述植物乳杆菌食品级表达系统包含食品级宿主植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NZ5333、食品级表达载体pSIP497、培养基MRS‑Y和培养基MRS+N；所述食品级宿主植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NZ5333是采用Cre‑loxP技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的glmS基因而获得，丧失合成葡萄糖胺‑6‑磷酸合成酶的能力。所述表达系统在异源蛋白表达中应用，表达效果好。所述表达系统为食品级表达系统，其DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用。

背景技术

随着科学技术的发展，越来越多的研究表明，乳酸菌在免疫调节、维持肠道内菌群平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症、抑制致病菌和降低血清胆固醇含量及预防心血管疾病等方面有显著影响。由于乳酸菌具有公认的生物安全性(generally recognized assafe，GRAS)，开发利用其作为基因工程载体菌株则在食品开发、营养健康及医疗卫生领域中具有相当大的潜力和价值。目前，已经有使用乳酸菌基因工程载体生产功能性蛋白、研制口服疫苗以及开发新药等研究的报道。值得注意的是，乳酸菌中对乳酸杆菌的研究尤其是研究的热点，一方面具有显著益生功能的乳杆菌的报道层出不穷，如嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及罗伊氏乳杆菌等，另一方面由于乳杆菌来源广泛，发酵性能佳，也是工业上尤其是食品工业上的重要菌种，如德氏乳杆菌等。

传统的乳酸菌表达载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素)抗性的基因，虽然抗性标记保证了转化子筛选的有效进行，但抗性标记的可转移性和潜在威胁显著降低了分子遗传修饰的乳酸菌在食品和医学领域的实用价值，因而，迫切需要开发食品级筛选标记，建立在异源蛋白中表达的食品级表达系统。

现有技术中关于食品级筛选标记分为两大类，即显性筛选标记和互补筛选标记。显性筛选标记通常是利用宿主菌的特性比如细菌素抗性、热敏性、糖类利用率等来达到筛选目的，如开发较为成熟目前应用最为广泛的来源于乳酸乳球菌乳链菌素Nisin筛选标记；互补筛选标记，一般利用了细菌某些基因如持家基因的缺失或突变引起细菌生长变化来达到筛选目的，如乳酸乳球菌胸苷酸合成酶基因thyA基因筛选标记、植物乳杆菌丙酮酸消旋酶alr筛选标记和干酪乳杆菌Q-5/pQJ5筛选系统。目前已开发应用的乳酸菌食品级筛选标记很少，不能满足很多目的蛋白食品级表达的需求，更多新的筛选标记尚待开发。本发明公开了以植物乳杆菌glmS基因作为筛选标记的表达系统，是乳酸菌异源表达中的新的筛选标记。葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(Glucosamine-6-phosphate synthase,GlmS)能够促使6-磷酸果糖和L-谷氨酰胺转化成6-磷酸氨基葡萄糖，是葡萄糖代谢途径己糖胺通路和细胞壁合成反应的限速酶。葡萄糖胺-6-磷酸合成酶在HBP催化的产物是N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和氨基葡糖(GlcN)，这两种葡萄糖胺对生物体生命活动具有重要意义，许多生物细胞的多糖如壳多糖和黏多糖都是通过N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)最终合成的，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)也是合成双岐因子的重要前体。glmS是葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因，研究表明没有glmS编码基因，菌株在不含氨基葡糖或N-乙酰葡萄糖胺的培养基中均无法正常生长，细胞会快速裂解死亡。此外，由于葡萄糖胺-6-磷酸合成酶是食品级分子，因此选择glmS基因作为筛选标记，开发其为植物乳杆菌的食品级表达系统，为乳酸菌在食品及医学领域的应用研究提供了一种有效安全的手段。

发明内容

针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用，该套植物乳杆菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有DNA原件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记。