[发明专利]原代肝细胞分离和培养方法

说明书

本发明提供一种原代肝细胞分离和培养方法，包括：步骤S1，穿刺活检肝组织，得到肝组织样本；将所述肝组织样本切碎，得到组织碎块；步骤S2，将所述组织碎块消化、过滤后获得第二组织碎块；步骤S3，将所述第二组织碎块接种在培养装置中进行扩增培养。该方法对肝组织来源门槛要求低，组织来源广泛，手术风险小，且步骤简便易行，操作性强，节约时间，降低成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原代肝细胞的分离和培养方法。

背景技术

肝脏是人体内重要的器官，具有参与物质代谢、分泌性蛋白的合成、毒素生物转化等功能。肝细胞作为组成肝脏的主体，在生命医学领域有极为广泛的应用，例如，在肝细胞移植、生物人工肝、基因治疗及药物研发等方面都有较高的应用需求。但是，在一般培养条件下，原代肝细胞在体外培养的时间短，分化功能维持时间短，特异性功能迅速降低，限制了肝细胞的应用。

目前，主要的原代肝细胞分离方法是两步原位灌流法，先从门静脉用无钙、含氧前期缓冲液，冲出血细胞和钙离子，再换含蛋白水解酶的溶液至组织软化。此种方法分离获得的肝细胞纯度高、数量多、活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。但是此种方法所需要的供肝来源少，灌流过程耗费的时间长，花费大，操作环节多，技术要求较高，过程易污染。

现针对手术切除的肝组织样本，可采取多点穿刺胶原酶灌注法获得原代肝细胞，分离的肝细胞悬液通过滤网初步筛除较大的组织块、筋膜等，然后采用密度梯度离心的方法获得较纯的肝细胞。例如，公开号为CN102061284A的发明专利公开了一种采用多点穿刺胶原酶灌注法，针对手术切除获得的人肝组织来进行的人原代肝细胞的分离培养方法，该方法克服了手术样本无法体外灌流的缺点。但是此种方法需要样本具备一定的体积和重量，并且具备较为完整的包膜，临床不易获取，从而限制了该方法在一般实验室以及人原代肝细胞在医学中的应用。

因此，有必要设计一种新的原代肝细胞的分离及培养方法以解决上述技术问题。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种针对微量肝组织块的原代肝细胞的分离及培养方法，该方法组织来源广泛，手术风险小，且步骤简便易行，操作性强，成本低。

本发明的第一个方面是提供了一种原代肝细胞分离和培养方法，包括：

步骤S1：穿刺活检肝组织，得到肝组织样本；将所述肝组织样本切碎，得到组织碎块；

步骤S2：将所述组织碎块消化、过滤后获得第二组织碎块；

步骤S3：将所述第二组织碎块接种在培养装置中进行扩增培养。

进一步地，所述组织碎块大小为0.5-2mm³。

进一步地，步骤S2中，将所述组织碎块用胶原酶溶液消化，过滤，得到初步消化的组织碎块；将所述初步消化的组织碎块移入第一消化液中消化，过滤后获得所述第二组织碎块；所述第一消化液选自胰酶、胰酶替代物、胰蛋白酶或胰蛋白酶替代物中的至少一种；所述胰酶替代物为Accutase细胞消化液；所述胰蛋白酶替代物为TrypLE。

进一步地，步骤S3中，将所述第二组织碎块密度调整为1-2个/cm²后，再接种在所述培养装置中。

进一步地，步骤S3中，将所述第二组织碎块接种在所述培养装置中，加入肝细胞扩增培养基进行扩增培养；所述肝细胞扩增培养基是由基础培养基和添加的营养成分组成，所述的基础培养基为WilliamsE或DMEM/F12培养基；所述的添加的营养成分包括5％-10％的血清或血清替代物。

进一步地，步骤S3中，将所述第二组织碎块进行研磨，过滤，离心，收集细胞；向所述细胞中加入红细胞裂解液，吹打，室温静置，离心分离得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀重悬于所述肝细胞扩增培养基中，得到细胞悬液，将所述细胞悬液接种于所述培养装置中进行扩增培养。