[发明专利]一种获得抗萎蔫绣球花的方法

权利要求书

1.一种获得抗萎蔫绣球花的方法，其特征在于，所述方法包括向绣球植株中引入Xre纤维素过表达基因，使绣球植株表达Xre纤维素过表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤一、构建含有Xre纤维素过表达蛋白的重组克隆载体

将合成的Xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体Xre01-T，然后将重组克隆载体Xre01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时，在表面涂有IPTG和X-gal的氨苄青霉素的LB平板上生长过夜；挑取白色菌落，在LB液体培养基中于温度37℃条件下培养过夜，碱法提取其质粒，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase的TE溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用；提取的质粒经KpnI和BglI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体Xre01-T中插入的所述Xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，即Xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列正确插入，

步骤二、构建含有Xre纤维素过表达基因的重组表达载体

用限制性内切酶NcoI和SwaI分别酶切重组克隆载体Xre01-T和表达载体pCAMBIA2301，将切下的Xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列片段插到表达载体pCAMBIA2301的NcoI和SwaI位点之间，构建成重组表达载体pCAMXre01，其结构包括Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；prUbi：玉米泛素基因启动子；Xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列；tNos：胭脂碱合成酶基因的终止子；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因；LB：左边界；

将重组表达载体pCAMXre01用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，碱法提取其质粒，将提取的质粒用限制性内切酶NcoI和SwaI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体pCAMXre01在NcoI和SwaI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，即Xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列；

步骤三、获得转基因绣球植株

从绣球植株上剪取约2.0-3.0cm长的嫩茎，去掉叶子，先用自来水冲洗，再用毛刷擦上去污粉反复擦洗，然后用纯净水冲洗，在无菌条件下，依次用75％酒精浸泡10-20s，0.1％的升汞溶液浸泡6-8min，无菌水冲洗5-6次，最后将处理好的嫩茎切成约0.5-1.0长的带芽茎段，按照常规采用的农杆菌侵染法，与所述的重组表达载体转化的农杆菌共培养，接种在预启动培养基上，预启动培养基采用MS培养基，MS培养基加入6-BA 3mg/L，NAA0.1mg/L，外植体接种2周后，腋芽膨大萌动长出叶片，将上述获得的无菌芽转接到分化培养基上进行增值培养以扩大繁殖系数，继代过程中，绣球无菌苗的茎段易形成酚类物质，造成转接时污染率增加，可加入抗坏血酸进行处理，分化增殖到3-4cm高时，进行生根培养，以1/2MS作为基本培养基添加蔗糖35g/L，琼脂5.0g/L，IBA 1mg/L，最终获得转基因绣球植株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分化培养基配比优选地为MS+3mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.4mg/L GA。