[发明专利]一种痕量丝素蛋白富集方法

说明书

本发明公开了一种痕量丝素蛋白富集方法，包括以下步骤：1）不同丝素蛋白单克隆抗体的混合；2）耦联反应；3）免疫磁珠的获得；4）鉴定；5）耦联后免疫磁珠的丝素蛋白单克隆抗体固定化；6）丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠与丝素蛋白的结合；7）丝素蛋白的洗脱；8）检测；9）加标回收。本发明利用丝素蛋白的复合单克隆抗体制备免疫磁珠，并利用这种免疫磁珠富集痕量丝素蛋白，可以更好地进行考古土样中痕量丝素蛋白的提取，具有提取不同分解片段、富集效率高、操作简便、实验耗时短等多方面优势。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种痕量丝素蛋白富集方法。

背景技术

丝绸作为中华文明的重要发明之一,承载着极其丰富的文化、技术和社会内涵,为考古学、历史学、技术史的研究提供了珍贵的资料。已出土的丝绸残片表明丝绸的起源应不晚于5500年前。然而,从发现蚕丝纤维到将其织造成精美的丝绸必然需要长时间的发展。因此,我们的祖先开始使用蚕丝纤维的时间远早于5500年前。但是，丝绸的起源问题一直笼罩在迷雾中。如何利用科学的手段确定丝绸起源并源自中国，具有十分重要的历史和文化价值。

丝绸由蚕丝织成，蚕丝是由18种氨基酸构成的天然蛋白质纤维。在漫长的历史进程中，当年埋入墓葬或遗址中的丝织品早已失去了实体面貌，降解成肽段和氨基酸，或者成为痕迹，或者化入泥土，在肉眼下已经无法辨识，且年代越早的证据越难寻觅。如何在丝绸宏观形态消失的情况下探寻更早的证据成为了研究早期丝绸的关键问题。相对于完整的丝织物,无形的纤维丝素蛋白残留物更有可能保存下来,也有可能成为探寻早期蚕丝遗存的新证据。

在长达数百年甚至数千年的时间长河中，考古材料中剩余的丝绸含量微乎其微，因此在对样品进行检测之前进行考古材料中痕量丝素蛋白进行富集，以提高检测的准确性，同时又要考虑的操作上的简便以及耗时少的问题。

目前进行痕量丝素蛋白的检测有多种方法，其中ELISA检测方法是利用抗原抗体的特异性结合进行检测，是丝素蛋白生物检测的最新技术，但ELISA检测方法需要检测目的物丝素蛋白能够有一定的浓度，而在考古发掘样品中的丝蛋白经过长期的岁月和环境的侵蚀，土中剩余的丝素蛋白含量微乎其微，而且可能被分解成不同的片段，常用的溶液提取法很难得到足够的丝素蛋白，利用丝素蛋白不同抗原决定簇制备的单克隆抗体混合物，可以结合痕量丝素蛋白分解成的不同片段，提高检测的效率。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用免疫磁珠富集痕量丝素蛋白，从而将土样中的痕量丝素蛋白进行富集的方法。

包括以下步骤：

1） 不同丝素蛋白单克隆抗体的混合：取自鼠的重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的三种丝素蛋白单克隆抗体同质量浓度混合；

2）耦联反应：取蛋白 G包裹磁珠1mg加入到1mL、 pH为6.0、浓度为15mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，然后加入步骤1）中制备的混合抗体70μg，置于振荡器上室温耦联反应过夜；

3）免疫磁珠的获得：用磁力架收集步骤2）中耦联反应后的磁珠并去除上清液，得到重链分别为IgG1、IgG2b、IgA的丝素蛋白单克隆抗体免疫磁珠；

4）鉴定：另取1mg未耦联的磁珠和步骤3）中耦联后的磁珠在55-65℃下烘干，进行傅里叶红外检测，观察1541cm^-1处的特征峰，确定耦联状态；