[发明专利]一种可变条带数量的DNAmarker及其制备

说明书

本发明设计一种可变条带数量的DNA marker及其制备，所述的DNA marker用3组分别标记低分子量(100‑1000bp)，中等分子量(1500‑6000bp)，大分子量(5000‑20000bp)三组marker，每组marker只含有少数条带，且这些条带相互之间不冲突可以相互叠加使用。对于标记单一DNA片段的时候可以每组单独使用，可以节约成本。对于标记较大范围内变化的DNA条带可以根据需求组合使用，形成超级marker，形成15条比较均匀的marker条带，满足复杂的需求。

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程领域，涉及DNA marker，尤其涉及一种可变条带数量的DNA marker及其制备。

背景技术

基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外分子水平上对DNA进行切割、连接、转化等一系列操作的过程，构建杂种DNA分子。基因工程是在分子生物学和分子遗传学的基础上综合发展起来，但其在生命科学、生物医学等领域的研究和应用中起到了非常巨大的作用。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

在DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的扩增、纯化、切割、连接等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA扩增和电泳。DNA扩增是指通过PCR技术强大的扩增能力，在DNA聚合酶的作用下，根据特定的模板设计特定的引物扩增出不同大小的DNA片段。DNA电泳是指利用DNA在中性缓冲液中带负电的性质，在一定的电场作用下，在特定的支持介质中(比如琼脂糖凝胶)，不同大小的DNA片段由于带有的电荷量以及空间位阻等的不同而在介质中具有不同的泳动速度从而得以分离的过程。DNA扩增和电泳是基因工程中最基本的技术。

在凝胶电泳中，在一定的范围内，具有相同构型的DNA在相同的凝胶浓度和电场强度下，其迁移率与DNA分子的大小呈线性关系。因此，可以用一组分子量已知的DNA片段混合物来指示未知DNA分子的大小。这种由一组分子量已知的，电泳后按其分子量大小和迁移率的不同可以在凝胶上形成一个DNA片段分布梯度，从而可以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量的DNA片段混合物就成为DNA分子量标准，简称DNA marker。DNA marker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。尽管实现DNA marker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA marker还是有相当的难度。目前各实验室中DNA marker的使用大部分是从商业公司购买，而且由于DNA marker是消耗品，每个实验室中的使用量非常大，具有广阔而良好的市场前景。按照DNA marker制备所涉及的关键技术,其制备方法可以分为限制性内切酶酶切和PCR扩增两种方法；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体。PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。

PCR扩增法是最常用的。虽然工作简单，但是重复成本高，长片段扩增效率低，并且还需要在回收后根据产物的亮度合理配比以达到最佳效果，可重复性差。酶切质粒的方法前期投入大，但是可以在前期设计的时候充分考虑各个分子量大小的浓度配比，使得酶切后的各分子量级别浓度达到最佳状态，并且产品各批次之间的基本没有差异。

酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性，温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法是用于以单位长度递增的DNA marker(比如100bpDNALadder，条带为100bp，200bp，300bp等依次递增)的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA marker质量较好。