[发明专利]一种阪崎克罗诺杆菌快速检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种阪崎克罗诺杆菌快速检测试剂盒，试剂盒包括干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液。本试剂盒中的6条引物对应阪崎克罗诺杆菌特异性靶基因序列的8个区段，通过加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全卫生领域中的阪崎克罗诺杆菌快速检测。另外，本发明为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对阪崎克罗诺杆菌的快速检测，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种微生物快速检测试剂盒，特别涉及一种阪崎克罗诺杆菌快速检测试剂盒。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)是一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，其具有周身鞭毛、动力以及产黄色素等特征，属于克罗诺杆菌属(Cronobacter)。阪崎克罗诺杆菌是常见的食源性条件致病菌，已被国际食品微生物标准化委员会(InternationalCommission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌，其广泛分布于机体以及自然环境中，主要感染婴幼儿并引发坏死性小肠结肠炎、脑膜炎以及败血症及等严重病症，尤其是对免疫力低下、体重偏低、早产等婴幼儿危害更大，表现出极高的后遗症并发率和死亡率。另外，也有研究显示，该菌会感染老年人或免疫力低下的成年人群。已有的研究对阪崎克罗诺杆菌具体致病机制以及污染源等尚不清楚，因此加强对食品尤其是婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎克罗诺杆菌的监测至关重要。目前对阪崎克罗诺杆菌的检测主要依据美国食药局(FDA)推荐的传统检测方法、免疫学法以及实时荧光定量PCR法等，但这些方法表现出检测周期长、操作复杂、仪器昂贵、成本高等不足，并且多局限在实验室检测，难以满足在基层现场的快速检测需求。

LAMP技术是由Notomi等人在2000年开发的一种新型的体外恒温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用2对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶进行快速的核酸扩增反应，反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规PCR相比，恒温扩增不依赖专门的仪器，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上优于PCR技术，可以实现现场的快速检测，并且其成本远低于荧光定量PCR。在常规的操作中均需配制相应的反应体系溶液再进行扩增，多次操作容易造成结果的偏差，并且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是Bst DNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法为非标方法，尚未在食品安全、医药等领域推广开来，已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方法和方式均无提及，加之市场上基于LAMP技术的阪崎克罗诺杆菌快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。

发明内容

本发明的目的在于针对现有阪崎克罗诺杆菌的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化阪崎克罗诺杆菌快速检测试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足相关食品的生产、流通中各个环节的快速检测的需求。

本发明所采取的技术方案是：

一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP引物组，其外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：

阪崎克罗诺杆菌-F3：tgcgtgctacagcggctatg

阪崎克罗诺杆菌-B3：gtgcgatgtcgatcattcact

阪崎克罗诺杆菌-FIP：atgcgtgcagctccgtgtagtgcgtgcagctgctttgtcact