[发明专利]一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法

权利要求书

1.一种悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括：

1）. 驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境；

驯化H5亚型重组禽流感病毒或H7亚型的重组禽流感病毒种毒使得其适应全悬浮培养环境下的MDCK细胞培养；

2）. 取经摇瓶培养好的悬浮MDCK细胞，接种于1L~7L的生物反应器中进行预培养，随后逐步放大培养直至终级反应器；待终级反应器细胞密度达到8.0×10^6.0～1.0×10^7.0个细胞/ml时接入步骤1）中驯化好的病毒进行病毒培养；

所述终级反应器为3000L~6000L的生物反应器；

3）. 当CPE达到75%以上时收获病毒液并取样检验病毒质量；

将所述病毒液中的病毒纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品；

4）. 将所述疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品；

步骤2）中，在所述终级反应器中培养细胞时，控制pH=7.0±0.2；在稳定pH时需要确定细胞培养基中的主要酸性物质，其方法包括：

201）、培养开始前，测定所述细胞培养基的pH值，记为A值；

202）、在培养过程中，从培养细胞的生物反应器中取培养基，测定所述培养基的pH值，记为B值；

203）、摇动所述细胞培养基，使其中的气体溢出，待气体溢出后，测定所述培养基的pH值，记为C值；

204）、比较A值、B值和C值之间的大小，确定所述细胞培养基中酸性物质的主要种类：

如果C值-B值＞0.2，且A值-C值＞0.2，则二氧化碳和乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质；

如果C值-B值＞0.2，且A值-C值≤0.2，则二氧化碳为细胞培养基中的主要酸性物质；

若C值-B值≤0.2，且A值-C值＞0.2，则乳酸为细胞培养基中的主要酸性物质；

所述方法还包括205）. 根据步骤204）的分析结果，采取不同措施调整细胞培养基中的pH值：

当所述细胞培养基中的主要酸性物质为二氧化碳时，向所述细胞培养基中通入压缩空气，以脱除细胞培养基中的二氧化碳；

当所述细胞培养基中主要酸性物质为乳酸时，向所述生物反应器中添加碱性物质，中和所述乳酸；

当所述细胞培养基中主要酸性物质为二氧化碳和乳酸时，向所述生物反应器中通入压缩空气，之后添加碱性物质，中和所述乳酸。

2.根据权利要求1所述的悬浮细胞生产重组禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述驯化MDCK细胞使其适应全悬浮培养环境的方法包括：

MDCK细胞用胎牛血清含量为8%的DMEM/F12培养基传代培养3次；

用胎牛血清含量为5%的DMEM/F12培养基传代培养5次；

用胎牛血清含量为2%的DMEM/F12培养基传代培养5次；

用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2%，传代培养7次；

用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2%，传代培养6次；

用低血清培养基传代培养5次；

消化、离心，得到的细胞用低血清培养基以转速为20-30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/L进行换液，待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约4.8×10⁵-5.2×10⁵个细胞/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株；

收集细胞，然后采用低血清培养基与无血清培养基的混合液培养，并逐步提高无血清培养基的含量，生长稳定后，得到无血清悬浮培养的MDCK细胞。