[发明专利]一种MDCK悬浮细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种MDCK悬浮细胞的制备方法。

背景技术

目前成熟的培养方式主要有单层静置贴壁培养、吸附法培养。

单层静置贴壁培养，属于静态培养过程。该方法下MDCK细胞静置贴附于方瓶或滚瓶等容器表面，然后细胞扩增生长直至形成单层。优点：由于细胞贴附在物体表面，无需离心即可实现细胞与培养基的分离；细胞清洗方便；便于观察细胞形态。缺点：受到方瓶、滚瓶贴壁比表面积小的限制，达到较高的细胞密度必须提供更多的贴附面积，占用大量场地面积；细胞传代需消化，细胞扩大培养较难；细胞取样计数比较困难。

吸附法培养，是固定化培养法的一种，该法是将MDCK细胞贴附于葡聚糖类微载体，细胞利用微载体的表面进行贴壁生长的培养方式。优点：相比于静置培养方式，微载体悬浮培养有很大的优势，比如：提供较大的比表面积；易于观察与控制；容易实现细胞与培养液的分离，便于灌注培养；节省空间；具有较好的气液传质特性。缺点：也存在一定局限性，比如：细胞难以消化传代；微载体悬浮放大过程中，放大比例较小；微载体价格昂贵；回收微载体的过程复杂。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种MDCK悬浮细胞的制备方法，该方法通过逐步驯化得到，方法简便，易于规模化生产。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种MDCK悬浮细胞的制备方法，包括以下步骤：

MDCK细胞用胎牛血清含量为8％的DMEM/F12培养基传代培养3次；

用胎牛血清含量为5％的DMEM/F12培养基传代培养5次；

用胎牛血清含量为2％的DMEM/F12培养基传代培养5次；

用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:1混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养7次；

用DMEM/F12培养基与低血清培养基按照体积比为1:5混合培养液培养，其中新生牛血清含量为2％，传代培养6次；

用低血清培养基传代培养5次；

消化、离心，得到的细胞用低血清培养基以转速为20-30r/min进行摇床培养，测定葡萄糖含量，低于1g/L进行换液，待细胞比生长速率稳定后，每次传代前密度调整为约4.8×10⁵-5.2×10⁵cells/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为低血清悬浮培养的细胞株；

收集细胞，然后采用低血清培养基与无血清培养基的混合液培养，并逐步提高无血清培养基的含量，生长稳定后，得到无血清悬浮培养的MDCK细胞。

本发明中低血清培养基和无血清培养基均购自甘肃健顺生物科技有限公司。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基，为市售产品。

本发明提供的MDCK悬浮细胞的制备方法，通过大量实验逐渐摸索得到，先通过逐步降低血清含量制得低血清贴壁培养的细胞株，再经过逐步增加培养转速，细胞逐渐失去黏附瓶壁的依赖，同时也协调使用胎牛血清转变为新生牛血清，然后再配合逐渐提升无血清培养基的含量进行驯化摇床培养，制得无血清悬浮培养的MDCK细胞。该方法简便，易于工厂化生产。

在低血清培养基培养过程中，少量贴壁细胞变圆，并且培养液中有悬浮细胞，继续扩增适应培养。然后先以较低的转速进行培养，为了细胞更好的适应摇床培养，进一步地，以转速为20-30r/min进行摇床培养时的细胞密度为0.8×10⁶-1.2×10⁶cells/ml。由于细胞之间也会存在依赖性以及信息的传导，为了使得细胞更好的适应摇床培养，细胞密度也要适当。

进一步地，逐渐提高转速为每次提高转速20-30r/min。通过逐渐提高转速，细胞逐渐失去黏附培养基壁的依赖性。

为了更好的使得细胞性能稳定，进一步地，每次转速适应培养3-5代。

进一步地，最终转速提高到80r/min，细胞完全失去黏附瓶壁的能力。转速提高到80r/min后，再传代5次以上培养，得到性能稳定的低血清悬浮培养的细胞株。一般传代5-6次。

MDCK细胞的无血清驯化，原因如下：

1)培养基中的血清不利于禽流感病毒的增殖，培养病毒工艺需要换液；

2)获得可在低血清条件下培养的细胞，倍增时间长。