[发明专利]Gal4温敏型突变体、重组表达载体、温度调控系统及其应用

说明书

本发明提供Gal4温敏型突变体，及利用其该突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统及其应用。利用Gal4温敏型突变体构建的温度调控操作简单，无需添加诱导剂/抑制剂，实现对代谢流的精细调控。有利于其它对细胞毒性大的物质的生产。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种定向进化改造酵母转录激活蛋白Gal4，以及利用改造后的Gal4突变蛋白构建温度调控的表达系统及其应用。

背景技术

随着代谢工程和合成生物学的发展，通过在酿酒酵母中表达异源基因来生产一些化学品变得越来越热门。但途径中的蛋白酶过表达以及外源代谢途径的中间产物积累，常常对宿主细胞造成毒害作用从而影响细胞生长。因此开发精确调控外源基因的表达至关重要。

目前半乳糖调节网络是酿酒酵母中被用于基因表达的一个常用有效的系统，在这个系统中Gal4能识别GAL基因启动子的上游激活序列(UASg),激活上述基因的转录。另外这个系统中GAL4的转录受到外界碳源的紧密调节，酵母细胞在没有半乳糖的培养环境中生长时，Gal80可以和Gal4特异性结合，阻止Gal4蛋白与GAL基因启动子区的结合，从而抑制GAL基因的表达。但是由于该诱导剂在发酵过程中会被消耗，需要不时补加，且价格比较昂贵，因此这种策略在大规模发酵中并不经济。有研究通过敲除GAL80，使GAL4的转录仅受到高葡萄糖抑制，低葡萄糖诱导。并成功地利用该系统在酿酒酵母中构建了可控的类异戊二烯高效合成途径。但是，利用葡萄糖进行长途径的表达调控在实际操作中并不严谨，常常会出现泄漏表达。而且在高密度发酵中工艺复杂，基因表达很难实现人为的控制。因此通过蛋白工程手段对Gal4进行进一步的改造，使它变成一种不借助于诱导剂/抑制剂，而是通过感知温度培养因子的变化来实现对代谢途径更加精细的调控，最终使菌体的生长与产物的积累相协调具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是通过定向进化的方法来获得温敏型的Gal4蛋白突变体，以实现在酿酒酵母中构建温度调控系统为目的并将其应用到代谢产品的生产中。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了Gal4温敏型突变体，所述突变体的氨基酸序列选自以下序列：

序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列；

序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

其中序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列命名Gal4M9，相对于野生型其第69位亮氨酸变成了脯氨酸，第356位丙氨酸变成了苏氨酸；序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列命名Gal4M61，相对于野生型其第385位缬氨酸变成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列命名Gal4M63，相对于野生型其第63位精氨酸变成了甘氨酸，第194位天冬酰胺变成了天冬氨酸；序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列命名Gal4M153，相对于野生型其第196位苯丙氨酸变成了亮氨酸，第297位谷氨酸变成了甘氨酸，第361为亮氨酸变成了丝氨酸；序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列命名Gal4M414，相对于野生型其第208位丝氨酸变成了脯氨酸。

进一步，编码Gal4温敏型突变体的核苷酸序列选自下列序列：

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；