[发明专利]一种检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法

说明书

本发明涉及一种检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集细胞、细胞固定、染色和流式检测与分析等步骤。本发明综合考察了胶基型嚼烟的暴露途径，作用方式，建立了全新的胶基型嚼烟前处理方法，且根据胶基型嚼烟作用靶细胞选取了人口腔角质细胞HOK作为细胞周期试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟对细胞周期影响的检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测胶基型嚼烟对细胞周期的影响。

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体涉及一种检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法。

背景技术

细胞是通过一个过程来完成复制的，这一过程被称为细胞周期（cell cycle）。细胞周期被划分为5个不同的时期：G0期（Gap 0 phase），指具有分裂的细胞在反复分裂数次之后，处于停止分裂状态的时期；G1期（Gap 1 phase），DNA合成前期，主要合成RNA和核糖体；S期，DNA合成期（DNA synthsis phase），除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。G2期（Gap 2 phase），为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期；M期，细胞分裂期（mitosis phase），细胞由一个母细胞分裂成为两个子细胞。当细胞内的DNA受到损伤时，可通过激活反应通路暂停细胞周期，对损伤的DNA进行修复，当损伤不能被修复时可通过诱发凋亡，清除变异细胞。细胞周期的阻滞是先于细胞凋亡和死亡的检测终点，能够更为灵敏的检测到受试物对细胞潜在的作用。

胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的Snus型口含烟，因此，有必要针对胶基型嚼烟自身特点建立适合胶基型嚼烟对细胞周期影响的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，为胶基型嚼烟的安全性评估提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种检测胶基型嚼烟对细胞周期影响的方法，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2 mL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；