[发明专利]一种NAD类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法

说明书

本发明公开了一种NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选方法。该方法中以亚磷酸敏感微生物为宿主，构建同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株；利用编码氧化还原酶突变体过表达系统的DNA样品转化平台菌株细胞，并将转化子在含有亚磷酸的环境中培养，在氧化还原酶突变体能再生NAD类似物的条件下，亚磷酸驱动亚磷酸脱氢酶突变体还原NAD类似物的同时被氧化成磷酸，菌株得以生长，所得生长正常的转化子过表达的氧化还原酶即具备偏好NAD类似物的特性。利用该方法将氧化还原酶突变体对辅因子偏好性和催化效率与细胞生长相偶联，用于高通量筛选表达NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体菌株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，旨在提供一种NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法，其基本原理是利用NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶耦合氧化还原酶将培养环境中亚磷酸转化为磷酸，从而使亚磷酸敏感微生物宿主细胞得以正常生长，并通过进一步分离鉴定得到NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)及其还原态NAD(P)H是生命过程中重要的辅酶，在细胞的能量代谢，信号传递，生长凋亡等生命过程中起到重要的作用(Ying,W.,et al.Antioxidants&Redox Signaling.2008,10,179)。由于NAD(P)参与胞内的多种氧化还原反应，并且NAD(P)⁺/NAD(P)H比例决定细胞内糖酵解，三羧酸循环等代谢途径，进而影响细胞生长代谢及代谢物的积累，现阶段通常采用辅因子工程对目标代谢途径进行调控。如，促进NAD(P)再生，增加NAD(P)H的合成，降低NAD(P)H的消耗等。但是，由于NAD(P)是一种通用的辅酶，调控胞内NAD(P)水平或不同氧化还原态往往会对细胞生理及代谢等产生全局性影响，很难实现在辅酶水平对特定的氧化还原途径进行调控。

利用NAD类似物为辅酶，构建依赖于NAD类似物的生物正交氧化还原体系，通过NAD类似物调控氧化还原途径，而不影响其他利用NAD(P)的代谢途径，同样，其他代谢途径中的NAD(P)也不会影响到生物正交代谢途径，实现特异性调控目标代谢网络，并对生物催化和合成生物学具有重要意义。目前已经报道的具有较好生物相容性的NAD类似物有：烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)，烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)，烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(NGD)(Ji,D.,et al.Journal of the American ChemicalSociety.2011,133,20857；赵宗保，王磊，刘武军，一种NAD类似物的还原方法，申请号：201410117146.6)。同时也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如苹果酸酶(ME，GenbankP26616)L310R/Q401C突变体、NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、亚磷酸脱氢酶psPDH(Genbank 069054)L151V/D213Q突变体和rPDH(Genbank AEQ29500)I151R或I151R/E213C突变体。利用不同的NAD类似物偏好型氧化还原酶，可以建立依赖于NAD类似物的生物正交氧化还原体系，用于控制细胞内代谢过程。因此，筛选NAD类似物偏好型氧化还原酶成为构建基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株的限制性因素。

目前，依赖于NAD类似物的氧化还原酶或NAD类似物合成酶主要通过突变筛选得到。筛选方法主要依赖于酶偶联显色法，将粗酶液与已有的能够识别目标NAD类似物的氧化还原酶进行偶联显色，从而实现对突变文库的筛选(Ji,D.,et al.Journal of theAmerican Chemical Society.2011,133,20857；赵宗保，王雪颖，刘玉雪，酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，申请号：201510940681.4)。这种筛选方法过程繁琐，筛选周期长，很难实现快速的高通量筛选，而有效的高通量筛选方法如流式细胞仪和微流控技术均尚不能应用于NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选，因此筛选方法成为筛选NAD类似物偏好型氧化还原酶的主要限制性因素。