[发明专利]一种提高哈维弧菌遗传转化的方法

说明书

本发明公开了一种提高哈维弧菌遗传转化的方法，对培养至对数早期的哈维弧菌受体菌进行热击处理后，再与培养至对数早期的携带表达质粒的供体菌进行接合。该方法针对传统的哈维弧菌的接合转化不成功或者效率低的问题，通过对接合受体菌哈维弧菌进行热击处理，建立起一种高效的接合转化的改良方法。

技术领域

本发明属于哈维弧菌技术领域，具体涉及一种提高哈维弧菌遗传转化的方 法。

背景技术

哈维弧菌广泛分布于海洋环境中，通常情况下是存在于海洋中的正常菌群， 当菌群的外部条件发生改变，或自身发生变异时，大量繁殖产生毒性，成为致病 菌，并侵染宿主致其死亡，在泰国、印尼、厄瓜多尔、澳大利亚、印度及中国等 国家广泛存在，是对虾的主要病原菌，可感染多种鱼、虾、蟹等并造成大量的死 亡。近年来，中国南海主要养殖鱼类的弧菌病病原出现以溶藻弧菌为主逐渐演替 为哈维弧菌为主的优势种群替代现象，给海水养殖业造成了巨大的经济损失。

哈维弧菌通过与宿主接触、粘附，进而侵袭、体内增殖并产生毒素，从而导 致宿主死亡。目前发现的哈维弧菌的致病因子主要有胞外蛋白酶、外膜蛋白、溶 血素、酯酶、磷脂酶、外毒素以及自身的分泌系统，但是具体致病机制仍不明晰。 致病机制研究通常涉及基因敲除、基因回补以及基因过表达等基因工程操作，而 这些方法通常通过基因接合转移法进行。目前，对于哈维弧菌的基因敲除工作， Teo JW、Bassler BL、Rattanama P等大多数研究者采用转座突变，转座突变的优 点是可以对基因组上的任意基因位点进行随机突变，但是其缺点是具有随机性、 工作量大、不能定向突变某一确定基因，并且易产生极性效应。传统的操作方法 更多使用大肠杆菌宿主细菌携带外源基因，通过其与受体菌细胞的接合转化从而 实现外源载体进入细胞内。但是在对转化子的筛选中，发现这种直接转化的方法通常在哈维弧菌中转化成功率极低甚至不能成功转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高哈维弧菌遗传转化的方法，该方法针对传统 的哈维弧菌的接合转化不成功或者效率低的问题，通过对接合受体菌哈维弧菌进 行热击处理，建立起一种高效的接合转化的改良方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：一种提高哈维弧菌遗传转化 的方法，对培养至对数早期的哈维弧菌受体菌进行热击处理后，再与培养至对数 早期的携带表达质粒的供体菌进行接合。

本发明在传统的接合转移法的技术基础上，通过对接合受体菌哈维弧菌热击 处理，使得哈维弧菌的接合转化效率从无到有，显著提高。

优选的，热击处理温度为37～46℃，此时受体菌与供体菌接合效果好。

作为本发明的其中一种优选的实施方式，热击处理温度为37℃时，热击处 理时间不低于30min，此时受体菌与供体菌容易接合，接合效率高。

作为本发明的其中一种优选的实施方式，热击处理温度为37～43℃时，热 击处理时间不低于10min，此时受体菌与供体菌容易接合，接合效率高。

进一步的，热击处理温度为37～43℃时，热击处理时间为15～120min，此 时受体菌与供体菌更易接合，接合效率非常高。

作为本发明的其中一种优选的实施方式，热击处理温度为43～46℃但不包括 端点值46℃时，热击处理时间不低于10min，此时受体菌与供体菌容易接合，接 合效率高。

进一步的，热击处理温度为43～46℃但不包括端点值46℃时，热击处理时间 为10～45min，此时受体菌与供体菌更易接合，接合效率非常高。

作为本发明的其中一种优选的实施方式，热击处理温度为46℃时，热击处 理时间不超过30min，此时受体菌与供体菌容易接合，接合效率高，超过这个 时间段，接合转化效率为零。