[发明专利]用于定量图谱分析核酸的方法

说明书

本发明用于定量图谱分析核酸的方法，本发明涉及一种用于建立标靶核酸分子群组的定量景观的方法。所述方法包含进行多种用于定量所述标靶核酸分子群组的每个标靶核酸分子的杂交反应以产生多种定量信号；产生两种定量信号之间的比率；和合并所述比率以用于构建所述标靶核酸分子群组的所述定量景观。根据本发明的方法能够图谱分析大量标靶核酸分子从而为各种应用提供具有高灵敏度及广泛动态范围的大数据标准化手段。

技术领域

本发明涉及一种分子检测技术。更确切地说，本发明涉及一种用于定量图谱分析核酸分子并进而用于生物和临床应用的方法。

背景技术

分子检测在临床诊断和分子生物学研究方面起重要作用。已研发出若干系统来进行分子检测，以便检测和/或鉴别样品中的靶分子。一般来说，生物中的分子事件由许多分子而非单个分子激起，并且因此图谱分析分子群组应该远比检测和/或鉴别生物样品内的单个分子更加重要。

已研发出用于图谱分析分子群组的若干检测程序并且大多数常常基于通常称为微阵列的方法。常规微阵列方法需要标记分子。然而，关于需要标记的缺点已使微阵列无法成为用于图谱分析分子群组的最常用和最方便的定量方法。此外，由于这类复杂性，错误肯定和错误否定已成为许多应用中的常见问题。

此外，由于分子子集的稀缺，如就微RNA(miRNA)而言，定量所有存在于特定样品中的分子颇具挑战性。“《使用全内反射荧光显微术的单分子水平的不同阶段的鼻咽癌血清样品中循环miRNA的直接定量(Direct quantification of circulating miRNAs indifferent stages of nasopharyngeal cancerous serum samples in single moleculelevel with total internal reflection fluorescence microscopy)》,西-洛克霍(See-Lok Ho),霍曼陈(Ho-Man Chan),安博瓦伊-夏恩(Amber Wai-Yan Ha),里奇诺克-顺王(Ricky Ngok-Shun Wong),和李洪永(Hung-Wing Li),《分析化学(Anal.Chem.)》,2014,86(19),第9880-9886页”中展示实例。即使存在针对定量这些罕见分子所研发的方法，但其需要酶/化学标记或酶扩增(《微RNA的直接检测和定量(Direct detection andquantification of microRNAs)》,埃里克A.亨特(Eric A.Hunt),安M.古尔丁(AnnM.Goulding),和萨普纳K.迪奥(Sapna K.Deo)；《分析生物化学(Anal Biochem.)》,2009年4月1日；387(1):1-12；《通过使用通用参比的微RNA的绝对定量(Absolute quantificationof microRNAs by using a universal reference)》,尤特比塞尔(Ute Bissels),史蒂芬维尔德(Stefan Wild),史蒂芬托姆克(Stefan Tomiuk),安吉拉霍斯特(Angela Holste),马库斯霍夫那(Markus Hafner),托马斯托斯克(Thomas Tuschl),和安德烈亚斯波西欧(Andreas Bosio),RNA,2009年12月；15(12):2375-2384；《使用竞争性杂交随后放大的伏安法检测的神经胶质瘤患者的血清中的低皮摩尔水平下的微RNA的直接定量(Directquantification of microRNA at low picomolar level in sera of glioma patientsusing a competitive hybridization followed by amplified voltammetricdetection)》,王健修(Jianxiu Wang),易欣耀(Xinyao Yi),唐海林(Hailin Tang),韩红星(Hongxing Han),徐明华(Minghua Wu),和周飞梦(Feimeng Zhou),《分析化学》,2012,84(15),第6400-6406页；《使用全内反射荧光显微术的单分子水平的不同阶段的鼻咽癌血清样品中循环miRNA的直接定量(Direct quantification of circulating miRNAs indifferent stages of nasopharyngeal cancerous serum samples in single moleculelevel with total internal reflection fluorescence microscopy)》,西-洛克霍(See-Lok Ho),霍曼陈(Ho-Man Chan),安博瓦伊-夏恩(Amber Wai-Yan Ha),里奇诺克-顺王(Ricky Ngok-Shun Wong),和李洪永(Hung-Wing Li),《分析化学(Anal.Chem.)》,2014,86(19),第9880-9886页；《外来体的微RNA含量的定量和化学计量分析(Quantitative andstoichiometric analysis of the microRNA content of exosomes)》,约翰R.彻维利特(John R.Chevillet),康青(Qing Kang),英格里德K.拉夫(Ingrid K.Ruf),希拉里A.布里格(Hilary A.Briggs),露西卡N.弗泰克(Lucia N.Vojtech),西恩M.胡格斯(SeanM.Hughes),海瑟H.成(Heather H.Cheng),詹森D.阿罗约(Jason D.Arroyo),艾米莉K.梅雷迪思(Emily K.Meredith),艾米莉N.格雷彻特(Emily N.Gallichotte),艾拉L.颇格索维(Era L.Pogosova-Agadjanyan),卡姆莫瑞斯(Colm Morrissey),德瑞克L.史迪尔沃特(Derek L.Stirewalt),弗劳瑞安海拉迪克(Florian Hladik),伊凡Y.余(Evan Y.Yu),塞拉斯提亚S.海格纳(Celestia S.Higano),和木尼斯特瓦力(Muneesh Tewari),PNAS,2014,111(4),第14888-14893页)。已十分理解扩增步骤是人为产物的来源。所有引物均并非同等地利用并且随着扩增周期的数目上升，偏倚日益放大。化学标记或酶扩增步骤是费力的，以及耗费时间和成本的。此外，化学标记或酶扩增的信号转换造成检测错误。所述缺点在定量单个或仅数个miRNA分子方面可以是可接受的；然而，不可能应用常规方法用于图谱分析miRNA分子或一般而言核酸分子的较大群组。