[发明专利]鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测方法

说明书

本发明公开了一种鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测引物及方法，属于生物技术领域。正向引物序列为5’‑GAAATACATTTTGGTC TAG‑3’，反向引物序列为5’‑aattctaatac gactcactatagggATTACTGGGAATAACTTGA‑3’，单增李斯特菌1/2c血清型检测用分子信标探针序列为5’‑JOE‑CGATCGAGGAAATGCTTATGCAGATA TTACGATCG‑DABCYL‑3’，检测方法包括下列步骤：单增李斯特菌RNA提取，实时NASBA反应，定性分析。本发明构建的引物和分子信标对单增李斯特菌1/2c血清型菌株的鉴定具有高度的特异性和灵敏度，所述的检测方法操作步骤简单，检测时间短，可进行实时定性分析，并且可对活菌和死菌有效区分。

技术领域

本发明涉及一种鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

在单增李斯特菌的13个血清型中，1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型菌株是最常从食品及临床病例中分离出的。据报道在中国分布的食源性单增李斯特菌大部分为1/2c血清型，相比较于其他血清型，1/2c血清型菌株能在室温、富营养或低营养、偏碱等食品加工及销售常见环境条件下生存，产生污染食品的物质，如生物被膜，易导致食源性李斯特菌病发生，因此建立能快速、有效、准确的单增李斯特菌血清型鉴定方法是十分必要的。

在检测活菌感染时，由于DNA的稳定性，即使细胞死亡，它仍能在检测体系中产生不必要扩增信号，会干扰实验结果。因此近年来，研究者开始将RNA分子作为靶点来检测和鉴定细胞的活性。由于mRNA和rRNA半衰期较短，比DNA更适合于活细胞检测。但是如果将mRNA用作靶点分子，则必须保证其反应过程中能进行转录。NASBA是以单链RNA序列为靶点的一步法恒温扩增反应，适合用于活菌检测。目前NASBA技术在国内外已广泛应用于病毒、细菌等检测，在我国NASBA已作为禽流感病毒的国标检测方法开始使用，NASBA检测方法有研究，多是以电泳直接检测扩增结果或者是结合ELISA，而基于分子信标的实时NASBA检测食源性致病菌的方法鲜有报道。

发明内容

技术问题

本发明提供了一种基于NASBA技术对单增李斯特菌1/2c血清型RNA具有特异性识别作用的引物和分子信标探针，同时利用该引物和分子信标探针构建一种快速、方便、准确的鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测方法。

技术方案

一种鉴定单增李斯特菌1/2c血清型的NASBA检测方法，其特征在于，所述NASBA检测方法特异性引物序列如下：

正向引物NM2c-F序列为5’-GAAATACATTTTGGTCTAG-3’，

反向引物NM2c-R序列为5’-aattctaatacgactcactatagggATTACTGGGAATAACTTGA-3’；

所述NASBA检测方法用分子信标探针MB2c，其序列为5’-JOE-CGATCGAGGAAATGCTTATGCAGATATTACGATCG-DABCYL-3’，所述的分子信标探针在5’端标记荧光报告集团JOE，3’端标记荧光淬灭集团DABCYL。

所述NASBA检测方法包括以下步骤：

(1)单增李斯特菌RNA提取

收集对数后期的菌悬液细胞，加入溶菌酶，采用Trizol法进行RNA提取。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存；

(2)实时NASBA反应