[发明专利]一种类弹性蛋白-抗EGFR纳米抗体-iRGD的双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法和用途

说明书

本发明公开了一种基于类弹性蛋白的双靶向融合蛋白，即类弹性蛋白‑抗EGFR纳米抗体‑iRGD的双靶向融合蛋白，是基于基因重组技术构建含ELP、抗EGFR纳米抗体、iRGD基因的重组质粒，并在大肠杆菌中表达纯化的双靶向融合蛋白。它可以偶联药物阿霉素，形成ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体。ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的水合粒径在5nm左右，主要以分子状态存在，显示了良好的阿霉素缓释功能和对肿瘤细胞的靶向功能。本发明公开了ELP‑抗EGFR‑iRGD双靶向融合蛋白阿霉素偶联体的制法。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及用于肿瘤治疗的酸敏感的双靶向抗体药物偶联体的制备。

背景技术

近年来，我国患癌人数呈现不断增加的趋势，癌症的多样化，恶性化以及难治愈性都对治疗技术的发展提出了很高的要求。目前最有效的肿瘤治疗方法仍然是化疗，但化疗药物一般是小分子药物，在体内循环时间较短。要想获得良好的治疗效果，常常需要多次化疗，伴随着较大的毒副作用。因此化疗对患者的伤害性比较大。其中，阿霉素(DOX)是一种广谱的抗肿瘤药物。它具有强烈的细胞毒性作用，作用机理主要是通过嵌入DNA而限制核酸的合成。它的分子量只有543.52Da，能被肾脏迅速的代谢，在体内循环时间很短，因而在肿瘤的富集量就比较低。要想达到良好的肿瘤治疗效果就必须加大注射剂量，而加大剂量就伴随着毒副作用的增加。阿霉素分子中含有酮键和氨基，都可以被用来进一步修饰。将阿霉素负载在纳米载体上，通过纳米载体的增强渗透滞留(EPR)效应来增加阿霉素在肿瘤的富集量，降低阿霉素对其他器官的毒副作用是一种常用的方法，但纳米载体容易被肝摄取，造成比较大的肝毒性。

随着科学技术的进步和医疗手段的不断发展，免疫疗法也取得了很大的进步。但是免疫疗法的适应性比较差，不如化疗药物多数具备广谱性。同时，免疫药物的制备比较繁琐，成本比较高，所以价格也比较高。不能适用于大多数人群。随着基因工程和免疫研究的发展，研究人员发现大部分的恶性肿瘤都会过表达表皮生长因子受体(EGFR)。EGFR是一种酪氨酸蛋白激酶受体，分子量在170kDa左右。现在已上市的EGFR抗体有西妥昔单抗、帕尼单抗等。虽然单克隆抗体对抗原的结合能力比较强，在肿瘤治疗方面也取得了一定的成功。但是其具大的尺寸限制了抗体在肿瘤中的渗透和获得更佳的治疗效果。同时复杂的制备过程和后期的人源化改造步骤繁琐，成本较高。纳米抗体也就是单域抗体，是目前为止自然存在的最小的抗原结合片段。纳米抗体又称为单域抗体是骆驼源的重链可变区，尺寸较小，在纳米级，分子量大约在15kDa左右，渗透性较完整抗体好。纳米抗体不含Fc段，也就减少了免疫反应，不需要后期的人源化改造步骤。同时纳米抗体可以很容易的通过基因重组技术在大肠杆菌中进行大量表达，进一步降低成本。肿瘤细胞因为其生长迅速，营养物质需求过大常会导致一些细胞表面的受体的过表达，比如整合素、铸铁蛋白受体等。抗体以及靶向细胞表面受体的活性蛋白分子都是用于肿瘤靶向治疗的良好选择。

本发明中，我们制备的双靶向融合蛋白药物偶联体是将不同特异性的蛋白融合在一起，再与化疗药物偶联的方法，其优势包括⑴改善小分子化疗药物的水溶性和稳定性，提高体内循环时间；⑵降低脱靶行为的发生；⑶将药物更多的输送到肿瘤部位，提高药物在肿瘤的富集量；⑷降低化疗药物的毒副作用，提高药物的注射剂量，提高抗肿瘤治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于类弹性蛋白的对EGFR和整合素双靶向的融合蛋白，其中靶向基团分别采用抗EGFR的纳米抗体和iRGD短肽。

本发明所述的类弹性蛋白，是由48个VPGXG五肽构成的重复序列，其中X为K：V：F＝1：2：1(V、P、G、K、F均是氨基酸的缩写)。

本发明的另一目的在于提供一种基于类弹性蛋白含抗EGFR纳米抗体和iRGD的双靶向融合蛋白与阿霉素的偶联体及其制备方法。

本发明的技术方案如下：