[发明专利]用于大肠癌诊断的尿液microRNA生物标志物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于大肠癌诊断的尿液microRNA生物标志物、试剂盒及其应用。所述用于大肠癌诊断的microRNA生物标志物包含microRNA hsa‑miR‑92b‑5p、hsa‑miR‑4706、hsa‑miR‑3665、hsa‑miR‑3652、hsa‑miR‑3714和hsa‑miR‑550a‑3‑5p中的任意一种或两种以上的组合。所述试剂盒包括针对所述生物标志物中的部分或全部microRNA进行PCR检测所用的引物组及探针。本发明提供的生物标志物及相应引物组和探针可以用于制备诊断试剂盒，且其在应用于尿液样本的大肠癌诊断时，具有优异的灵敏度与特异性。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及用于RNA技术领域，特别是涉及一组用于大肠癌诊断的尿液microRNA生物标志物、试剂盒及其应用。

背景技术

大肠癌(Colorectal cancer，CRC)，也称结直肠癌，自大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤，也是胃肠道中常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌(都是大肠的一部分)。大肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠。大肠癌是全世界仅次于肺癌和乳腺癌的第三大常见恶性肿瘤，全球每年新增病例超过100万。近年来，随着社会经济的发展，居民生活习惯、饮食结构的改变以及人口老龄化的进程加快，我国大肠癌发病率和死亡率呈逐步上升趋势。

大肠癌早期无症状，或症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等，因此初诊的大肠癌以中晚期为主。现有的大肠癌诊断主要有乙状结肠镜和纤维结肠镜检查、X线检查、癌胚抗原(CEA)试验。肠镜检查能够检视肿瘤大小、形态、部位、活动度等，并对可疑病灶能定向镜取组织进行活检，因此是目前大肠癌诊断最有效的手段，在大肠癌普查中，常作为评价各种初筛检效果的金标准。但事实上很多高危人群因为不愿接受痛苦的肠镜而拒绝1-2年的定期筛查。另外，X线检查也是诊断大肠癌的有效手段，一般均行钡餐灌肠检查，主要征象为粘膜局部变形、蠕动异常等，但对较小的，特别是对于直径小于2cm的癌显示常有困难。此外，癌胚抗原(CEA)试验由于特异性并不强，在一些非消化道肿瘤及良性病变中血清水平亦可升高，对早期病例的诊断价值不大，只是对推测预后和判断复发有一定的帮助。因此，需要寻找新型无痛无创、高灵敏度和特异性的生物标志物来对大肠癌进行检测。

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为18-25nt的非编码RNA，在细胞内具有多种重要的调节作用，普遍认为与人类疾病的发生有密切联系。有证据表明，miRNA在肿瘤发生中起着类似于癌基因或抑癌基因的重要作用，可被运用到肿瘤的诊断和治疗监测中。此外，miRNA在体外很稳定，研究认为循环中miRNA主要由细胞分泌释放入血液，以外泌体(exosome)或蛋白复合体的形式存在，能够抵抗RNA酶的消化作用和苛刻的条件，从而在细胞之间传递生物信息。因此，已有文献报道了血清或血浆中的特定miRNA或miRNA组合用于大肠癌的检测中。Wang(Wang S，et al.2015)等研究显示血浆中的miRNA可用于大肠癌的早期检测，Sun(Yan Sun，et al.2016)等研究了血浆中的miRNA用于不同分期的大肠癌检测。但这些检测方式的样本均会给受检者造成一定的痛苦。

另一方面，尿液在维护机体健康，维持生命正常运转方面，发挥着不可替代的重要作用。由于尿液直接来源于血液，当血液流过肾小球毛细血管时，除血细胞和大分子蛋白质外，几乎所有血浆成分，包括少量分子量较小的血浆蛋白都能通过肾小球膜，滤到肾小球囊内形成原尿，因此尿液可以反映出很多有机体的生理变化。同时，尿液以代谢废物的方式排出，与血液类(如血清、血浆)样本相比，尿液可以非侵入的方式大量获得，不会对受检者造成额外痛苦。2004年科学家就发现人尿液中也存在着外泌体。然而，此前尿液样本只能用于泌尿系统癌症(如膀胱癌、肾癌)检测(Kristina S，et al.2016；Iddo Z，et al.2014)。2015年，Thalia等报道了尿液中的miRNA用于乳腺癌检测的可行性，这首次突破了尿液样本只能用于泌尿系统癌症检测的局限。但是，尿液样本是否还适用于其它非泌尿系统癌症(例如大肠癌)的检测，这仍是需要本领域技术人员通过大量的理论研究和实验才能解决的难题。