[发明专利]一种抗体的抗原结合片段-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗体的抗原结合片段‑海兔毒素偶联物及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：(1)提供C端具有LPXTG序列的抗CD20单抗的抗原结合片段、具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物；(2)在Sortase A酶催化下，LPXTG序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使所述抗原结合片段与具有寡甘氨酸接头的海兔毒素或海兔毒素衍生物进行偶联；(3)反应完成后，分离纯化得到所述抗原结合片段‑海兔毒素偶联物。本发明抗原结合片段‑海兔毒素偶联药物，保留了全抗‑海兔毒素偶联药物的特异性和亲和力，以及对CD20阳性肿瘤细胞的杀伤作用；并且具有较快的穿透肿瘤的速率及较高的肿瘤部位的聚集量。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种抗体的抗原结合片段-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。

背景技术

抗体是分子量(～150kDa)比较大的一类蛋白药物，难以透过血管内皮质及细胞间隙从而到达实体瘤深部的肿瘤细胞，因此到达肿瘤部位的抗体很少，Sedlacek等的研究表明抗体只有注射剂量的0.01％到达肿瘤部位(Sedlacek H-H,et.al,Antibodies ascarriers of cytotoxicity,Contributions to Oncology,1992；43:1-145)，这方面极大的限制了全抗在实体瘤方面的应用。那么无论从经济成本还是安全性考虑全抗都显示其不足之处，因此对全抗的小型化改造已经成为一种趋势。

小型化抗体研究的初期主要的研究类型是单链的ScFv及Fab等，这类小型化抗体保留了全抗的亲和性和特异性，但是也显示其不足之处—半衰期较短，因此抗肿瘤效果并不是很理想。为了提高这类小型化抗体的抗肿瘤效果，一方面尝试融合蛋白片段(PEG、Fc、HSA等)改善其药动学性质(Zhang H,et.al,Therapeutic potential of an anti-HER2single chain antibody–DM1conjugates for the treatment of HER2-positivecancer,Signal Transduction and Targeted Therapy,17015(2017).)；另一方面尝试偶联小分子毒素药物，利用抗体的特异性，将毒素小分子靶向的运输到肿瘤部位，通过毒性小分子的抑制细胞DNA或者蛋白合成、抑制细胞有丝分等作用特异性的杀伤肿瘤细胞。

抗体较长的半衰期主要是由于恒定区Fc片段与细胞表面的FcRn的作用，因此Fc片段常用于改造小型化抗体的药动学性质的(Natalia,The coming of age of engineeredmultivalent antibodies,Biotech Week,2015,20(5):589-593.)。在S.Dimitrov等人的研究中通过对IgG型抗体的恒定区CH3片段进行氨基酸突变改造，突变后的CH3mut相比野生型的CH3显示出较强的对FcRn亲和性，是用于改善蛋白半衰期的另一选择(YING T L,et.al,Engineered Soluble Monomeric IgG1CH3Domain,Journal of Biological Chemistry,2013,288(35):25154-25164.)。

传统的化学偶联方法得到的抗体偶联药物的DAR均一性差，体内代谢性质的评价比较困难，而且抗体的不均一性会造成其治疗窗较窄，治疗效果不佳。SortaseA酶是一种表达在金黄色葡萄球菌中的膜蛋白，可以特异性的识别LPXTG多肽序列通过亲核加成作用将氨基端带有甘氨酸的分子/多肽、蛋白加成到蛋白末端(Ton-That H,Purification andcharacterization of sortase,the transpeptidase that cleaves surface proteinsof Staphylococcusaureusatthe LPXTG motif,Proc Natl Acad Sci.1999,96:12424-9.)。利用这个性质可以构建羧基端具有LPXTG的抗体，利用sortaseA酶将氨基端含有甘氨酸的毒性小分子定点定量的偶联到抗体的羧基末端。

发明内容