[发明专利]一种基于双酶信号级联放大的微小RNA-21超灵敏检测方法

说明书

本发明一种基于双酶信号级联放大的微小RNA‑21超灵敏检测方法；包括辣根过氧化物酶标探针的制备：采用EDC偶联羧基氨基的方法，通过DNA单链将羧基化聚苯乙烯微球与辣根过氧化物酶进行偶联；双链特异性核酸酶辅助靶标回收：双链特异性核酸酶特异性切割探针中与待检RNA互补配对的DNA单链，引发靶标循环反应，导致切割释放更多的辣根过氧化物酶，实现信号放大；辣根过氧化物酶信号放大：收集上清中切割释放的辣根过氧化物酶，加入TMB显色底物，通过颜色变化实现裸眼定性，通过吸光度值的变化实现酶标定量。该方案很好地区分微小RNA家族成员的差异，适合高危人群的社区肿瘤筛选，在生物医学研究和临床诊断中具有很大应用价值。

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，更具体的是涉及一种新型基于双酶信号级联放大系统的微小RNA-21的超灵敏检测方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一种具有短长度(约22个核苷酸)的内源性非编码小分子，并与信使RNA结合以参与转录后水平的基因表达调控。大量的研究表明，微小RNA的异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤和癌症密切相关，例如miR-21在各种癌症中的存在过高表达。因此，作为重要肿瘤标志物的微小RNA可用于肿瘤的的诊断，治疗和预后，具有重要的临床意义。然而，由于其低浓度，小尺寸和高同源性等特征，实现其快速，简单，可靠和超灵敏的检测仍是一项巨大的挑战。

双链特异性核酸酶是一种热稳定性核酸酶，能够选择性地切割降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，而对RNA或者单链DNA几乎没有作用。此外，这种降解作用仅针对于至少12个完全匹配的核苷酸序列，因此它具有高度特异性。

辣根过氧化物酶(HRP)是临床试验酶联免疫吸附测定(ELISA)中最常用的酶，具有分子量小，标记简单，性质稳定，活性高的优点。它可以氧化许多显色底物以产生可见信号，这可以用肉眼或酶标仪进行检测。此外，HRP-TMB系统已经发展成为生物分析和检测中最常用的反应之一。

本文提出了一种基于双链特异性核酸酶辅助靶向回收策略和辣根过氧化物酶信号放大的新方法，实现了对微小RNA-21的超敏感检测。信号级联放大由两个因素实现，一个是基于双链特异性核酸酶选择性降解的特殊性质。在靶标微小RNA-21存在时，双链特异性核酸酶选择性地切割降解与酶标探针上与靶标微小RNA-21杂交的单链DNA，而不损害靶标微小RNA-21，导致靶标多次循环反应和更多游离辣根过氧化物酶的释放。另一个因素是基于辣根过氧化物酶与底物TMB的显色反应。由双链特异性核酸酶切割释放的辣根过氧化物酶与底物TMB发生反应，可根据颜色变化实现裸眼定性、可视化检测，根据吸光度变化实现对微小RNA-21的酶标定量检测。

但是由于该探针的制备采用了两步羧基氨基偶联反应，通过单链DNA将基苯乙烯微球与辣根过氧化物酶进行偶联，探针稳定性未达到最佳，有待进一步提高。此外酶需低温保存保持其活性，故现在无法实现比较稳定的商业化生产，有待进一步改进与优化。

发明内容

mi RNA的含量与人类肿瘤与癌症密切相关，但由于其具有低浓度，小尺寸和高同源性等特征，实现其快速，简单超灵敏的检测仍是一项巨大的挑战。我们将辣根过氧化物酶与双链特异性核酸酶进行结合，通过双联特异性核酸酶辅助靶标回收及辣根过氧化物酶级联信号放大，基于双重信号放大效应，从而实现对mi RNA快速与超灵敏检测。

本发明的技术方案如下：

一种基于双酶信号级联放大的微小RNA-21超灵敏检测方法，包括如下步骤：

1、辣根过氧化物酶标探针的制备：采用EDC偶联羧基氨基的方法，通过DNA单链将羧基化聚苯乙烯微球与辣根过氧化物酶进行偶联；

2、双链特异性核酸酶辅助靶标回收：双链特异性核酸酶特异性切割探针中与待检RNA互补配对的DNA单链，但保持待检RNA的完整性，引发靶标循环反应，导致切割释放更多的辣根过氧化物酶，实现信号放大；