[发明专利]一种八氢番茄红素脱氢酶突变基因及其在类胡萝卜素合成中的应用

说明书

一种八氢番茄红素脱氢酶突变基因及其在类胡萝卜素合成中的应用，所述的突变体基因是通过迭代定向进化手段对八氢番茄红素脱氢酶编码基因进行多轮突变，以及一种基于菌落颜色变化的高通量筛选方法，最终获得了八氢番茄红素脱氢酶的突变体基因；用所述八氢番茄红素脱氢酶突变基因合成番茄红素时，第一轮定向进化获得了A178S突变体，番茄红素产量提高27.3%；进而以该突变体为基础进行定向进化，得到A178S/N280T突变体和A178S/M234I两个突变体，番茄红素产量进一步提高51.4%和18.3%，而将A178S、N280T及M234I组合未能进一步提高番茄红素产量；继续对A178S/N280T突变体进行定向进化，获得A178S/N280T/E239P突变体，通过3轮定向进化和筛选，最终获得A178S/N280T/E239P突变体。

技术领域

本发明涉及的是一种八氢番茄红素脱氢酶突变基因及其在类胡萝卜素合成中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

在类胡萝卜素生物合成过程中，八氢番茄红素脱氢酶催化由八氢番茄红素生成番茄红素的连续四步脱氢反应，是途径关键限速酶。因此，提高八氢番茄红素脱氢酶的催化活性获得优选的八氢番茄红素脱氢酶对于提高类胡萝卜素生物合成路径的生产力有着至关重要的意义。

然而，目前关于八氢番茄红素脱氢酶CrtI 与底物结合的结构和结合机制尚未得到解析。在缺乏酶结构或催化机理信息的情况下，定向进化技术是提高酶催化性能的有力工具。因此，通过定向进化技术获得优选的八氢番茄红素脱氢酶能够有效提高类胡萝卜素生物合成的生产力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种八氢番茄红素脱氢酶的突变基因及其在类胡萝卜素合成中的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种八氢番茄红素脱氢酶突变体基因，所述的突变体基因是通过迭代定向进化手段对八氢番茄红素脱氢酶编码基因进行多轮突变，以及一种基于菌落颜色变化的高通量筛选方法，最终获得了八氢番茄红素脱氢酶的突变体基因。

作为优选：首先将来源于水生副球菌Agrobacterium aurantiacum的八氢番茄红素脱氢酶编码基因crtI插入解脂耶式酵母整合表达单拷贝载体pINA1269中，然后采用易错PCR技术对crtI进行突变，通过观察番茄红素生产菌株的菌落颜色变化的初筛方法和HPLC方法验证筛选正向突变体，并对目标正向突变体进行测序，获得了八氢番茄红素脱氢酶的突变体基因。

一种如上所述八氢番茄红素脱氢酶突变体基因在类胡萝卜素合成中的应用，用所述八氢番茄红素脱氢酶突变基因合成番茄红素时，第一轮定向进化获得了A178S突变体，番茄红素产量提高27.3%；进而以该突变体为基础进行定向进化，得到A178S/N280T突变体和A178S/M234I两个突变体，番茄红素产量进一步提高51.4%和18.3%，而将A178S、N280T及M234I组合未能进一步提高番茄红素产量；继续对A178S/N280T突变体进行定向进化，获得A178S/N280T/E239P突变体，番茄红素产量进一步提高40.3%；通过3轮定向进化和筛选，最终获得A178S/N280T/E239P突变体，该突变体将番茄红素产量从3.2 mg/g DCW提高到8.7mg/g DCW，提高了171.9%。

本发明通过迭代定向进化手段对八氢番茄红素脱氢酶编码基因进行多轮突变，以及一种基于菌落颜色变化的高通量筛选方法，最终获得了八氢番茄红素脱氢酶的突变体基因；应用上述八氢番茄红素脱氢酶突变基因合成番茄红素时，将重组解脂耶式酵母菌株生产番茄红素的产量较原始基因提高了171.9%。

具体实施方式