[发明专利]一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。

背景技术

随着社会进步和人们生活、饮食方式的转变，糖尿病发病率逐年增高。中国近期一项流行病学研究结果表明，中国的糖尿病患病率已达9.7％，高于世界平均水平6.4％。糖尿病患者因周围神经病变与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形形成，进而引发一系列足部问题，从轻度的神经症状到严重的溃疡、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折。如果积极治疗不能充分解决下肢出现的症状和并发症，则会造成灾难性的后果。糖尿病足是糖尿病最严重的并发症和非外伤性截肢的主要原因。随着我国人口老龄化的发展，糖尿病足发病率逐年增高，处理不当有可能会截肢或死亡，而85％截肢起因于溃疡。糖尿病足溃疡的发生使糖尿病患者生活质量降低，住院时间延长，给社会和家庭带来了巨大的经济负担，因此，在糖尿病患者中开展对足部问题的早期预防和治疗将有重要的意义。

目前，随着技术的发展和人们对糖尿病足溃疡认识的增加，越来越多的方法应用于临床。目前临床上一般采用药物、血管搭桥、介入手术、超声消融等方法治疗糖尿病足，但是均具有一定的局限性，难以取得令人满意的疗效，因此迫切需要寻求新的治疗方法。

人脐静脉内皮细胞是来源于人脐带静脉、具有干细胞潜能的一类细胞，具有取材容易，来源充足及操作简便等特点。内皮细胞可以通过分泌多种细胞因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)等，在血压调节，凝血和纤溶，炎性细胞的黏附和迁移，以及血管形成等生理、病理过程中发挥重要作用。这些细胞因子能改善机体局部微环境，增加细胞活力、促进细胞更新、促进受损细胞组织愈合，并诱导血管新生，对溃疡创口起到很好的治愈作用。尝试将内皮细胞分泌的生长因子应用于糖尿病足的防治具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供及一种组合物及其制备方法与在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。

本发明提供的组合物由静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆组成。

本发明中，所述富血小板血浆的制备方法为全血经1600rpm/min，离心10min后，丢弃红细胞层；然后5000rpm/min，离心5min，然后弃除部分血浆，使剩余的血浆重悬沉淀，制成富血小板血浆。其中，所述剩余血浆的体积为全血的1/10～1/2。

本发明中，静脉内皮细胞生长因子为脐静脉内皮细胞生长因子。

所述脐静脉内皮细胞为P2或P3代细胞。

所述脐静脉内皮细胞的获取方式为：将脐带去除血液并PBS缓冲液清洗后，以质量分数为0.1％的I型胶原酶溶液酶解脐带内壁，37℃消化10min；收集消化液，1500rpm/min，离心5min，收集细胞沉淀，以完全培养基(含有10vol％FBS的DMEM-F12培养基)重悬至密度为1×10⁵cell/mL～1.5×10⁵cell/mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。48h后首次换液，此后2～3天换液一次，直至细胞融合度达80～90％，传代。

本发明中，脐静脉内皮细胞生长因子的制备方法为：

预培养脐静脉内皮细胞至汇合度达到80％以上，清洗细胞后以选择培养基培养，3天后收集培养液，依次经0.45μm滤膜、0.22μm滤膜过滤后，浓缩至液体蛋白质浓度为800mg/L～1200mg/L；浓缩液用冻干机制成冻干粉，获得脐静脉内皮细胞生长因子；

所述预培养采用含1ng/ml～10ng/ml EGF和10vol％FBS的DMEM-F12培养基；

所述选择培养基为1640培养基。

一些实施例中，预培养的接种密度为1×10⁵cell/mL～10×10⁵cell/mL。

一些实施例中，预培养的时间为3天。

一些实施例中，浓缩采用超滤浓缩，循环时间为3h。

一些实施例中，浓缩至蛋白质浓度为1000mg/L。

本发明中，静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆的质量-体积比为1g/mL～5g/mL。

一些实施例中，静脉内皮细胞生长因子和富血小板血浆的质量-体积比为1g/mL。