[发明专利]基于三元融合蛋白的抗HPV宫颈护创敷料设计

说明书

本发明公开了一种抗HPV的宫颈护创敷料设计的方法。该敷料是基于国际同行对SERPINA3和IFN‑κ功能的研究以及本实验室对这两种蛋白性质的研究而设计的融合蛋白。具体方法为运用overlap extension PCR技术，获得了以氨基酸序列GGSGG为linker的SERPINA3与IFN‑κ共价连接的融合蛋白SERPINA3‑IFN‑κ的基因片段。将目的基因克隆入原核表达载体Pet30(改造)并扩大培养，经MBP柱亲和层析，即可获得纯度达90％以上的三元融合蛋白MBP‑SERPINA3‑IFN‑κ。我们在细胞和小鼠水平上验证了该融合蛋白对HSV‑1病毒复制的抑制作用。最终证明该融合蛋白易纯化，活性高，无副作用，非常适合作为抗HPV的宫颈护创敷料。

所属技术领域：

本发明属于生物工程领域，具体涉及到分子克隆，蛋白质表达纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，实时荧光定量PCR，小鼠皮肤创伤模型，病毒感染等技术。

背景技术：

HPV病毒(Human Papilloma Virus)，又称为人乳头瘤病毒，是宫颈癌的元凶。它是一种DNA病毒，人类是HPV唯一的宿主。HPV进入机体皮肤粘膜后，主要潜伏于表皮内基底细胞间，一旦时机成熟它就会致病。临床上90％以上的宫颈癌是由十几种高危型HPV病毒引起的，其中最为危险的是HPV16型和18型。根据美国的调查数据，有26.8％女性会感染一种或多种HPV病毒，而感染了高危型的则占15.2％。在中国，也有相似的感染率，且随着近年性生活态度的改变，在年轻一代中HPV的感染率有快速上升的趋势。

HPV通过密切的皮肤接触感染。80％感染者可以用1-2年的时间，通过机体的免疫能力将其清除。不能清除而持续感染者，发展为宫颈癌前病变的可能性大大增加。目前科学家已证明了经性生活传染的HPV病毒是引起宫颈癌的主要病因。近年来由于大多数患者对HPV疾病认识不足，导致其发病率及复发率持续增长，但相应的治疗手段却很不完善。目前治疗HPV的方法虽多，但普遍使用传统的治疗手段：如手术、激光、外涂药物等，其目的都只是去掉临床肉眼可见疣体，却难以解决亚临床及潜伏感染的问题，造成治标不治本致使反复发作。

目前虽然已有HPV疫苗进入临床使用，但并没有得到广泛的推广，在人群中接种率很低。而且疫苗只能针对几种亚型，难以覆盖目前感染人类的十几种HPV病毒。疫苗也没有治疗的效果，对已经感染的人群没有作用。由于目前人群，特别是年轻人群中HPV的高感染率，我们急切需要一种能够直接应用于子宫颈细胞表面，并且能够高效的抑制或清除HPV感染的敷料。

目前在人群中得到部分使用的HPV敷料，有金波抗HPV生物蛋白敷料(山西锦波生物医药股份有限公司)，瑞贝生等。二者所用的活性蛋白质从作用机制上，都是针对HPV病毒的侵染和复制过程。但是，由于HPV在体内的复制效率很低，活体组织上很难检测到活的HPV病毒。HPV感染所引起的宫颈癌和其他病症往往是由于HPV致癌基因整合，慢性感染，长期低剂量复制对宿主的影响而引起的效果，所以直接针对HPV活跃病毒的复制而进行抑制难于有好的效果。基于此，我们希望寻找能够针对宿主子宫颈细胞的损伤进行调理，并调节子宫领细胞的抗病毒免疫过程来达到预防和治疗的效果。

HPV感染后难以清除，一是由于子宫颈上皮细胞本身容易受到损伤，产生微创，给病毒传播产生了通道；二是由于子宫颈上皮细胞的局部免疫系统不活跃，容易给病毒有可乘之机。针对HPV通过微创进入，子宫颈上皮细胞局部免疫系统不活跃的两大特点，我们的两种活性蛋白，SERPINA3和IFN-κ，协同作用，会有效解决HPV不宜清除的难题。

(1)SERPINA3，是一种近来发现的胰凝乳蛋白酶抑制剂，外敷时可以帮助上皮细胞的微小创口愈合，促进局部皮肤再生。参考文献：Hoffmann et al，J.Biol.Chem.，2011，286，28889-28901。