[发明专利]过表达异源谷氨酰胺合成酶的基因工程菌及其构建方法

说明书

本发明提供一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌及其构建方法。合成并优化来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA；通过酶切连接的方法，将基因glnA连接在大肠杆菌‑谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA；将表达载体pXMJ19glnA导入谷氨酸棒杆菌GM34或谷氨酸棒杆菌TP607，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA或TP607/pXMJ19glnA。本发明所述基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶，显著提高了L‑谷氨酰胺的产量。同时在L‑色氨酸生产菌中过表达该酶，L‑色氨酸产量显著提高。

技术领域

本发明涉及一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于微生物代谢调控和基因工程技术领域。

背景技术

细胞内一些重要的酶促反应依赖L-谷氨酰胺提供氨基供体转氨反应，L-谷氨酰胺脱氨基后生成L-谷氨酸。L-谷氨酰胺的再生是通过谷氨酰胺合成酶催化L-谷氨酸和铵盐反应来完成的。细胞内L-色氨酸、氨基葡萄糖、透明质酸等的合成涉及谷氨酰胺转氨反应，其大量积累需要L-谷氨酰胺的快速合成。

然而，谷氨酰胺合成酶会发生腺苷酰化现象，导致其酶活急剧降低。AMP以共价键方式与谷氨酰胺合成酶肽链上的酪氨酸残基(Tyr)结合使得其发生腺苷酰化反应，进而使谷氨酰胺合成酶活性降低甚至丧失。在铵盐极大程度地超过需求量时，腺苷酰化程度加强，谷氨酰胺合成酶活性下降甚至失活，但L-谷氨酰胺的生成又不可缺少铵盐供应。此外，在氨基酸、有机酸等发酵过程中，由于胞内产物积累导致pH下降，此时常规微生物谷氨酰胺合成酶的酶活较低。目前，L-谷氨酰胺的生成菌株由于谷氨酰胺合成酶会发生腺苷酰化的现象，其活力会急剧降低，严重限制了L-谷氨酰胺的合成和生产。因此，寻求高活性谷氨酰胺合成酶来强化细胞内L-谷氨酰胺的再生，在生物合成L-色氨酸等产品中具有重要的应用价值。专利申请CN 106635946A公开了一种谷氨酸棒杆菌，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因被敲除。专利申请CN1884501A公开了一种可解除腺苷酰化修饰作用的谷氨酰胺合成酶，是自氨基端第405位氨基酸残基突变为L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的谷氨酰胺合成酶。专利申请CN 1550546A公开了一种具有L-精氨酸或L-赖氨酸生产能力的棒杆菌，该棒状杆菌经过修饰，使其通过腺苷酰化对谷氨酰胺合成酶的活性调节作用被减少或消除，使其谷氨酰胺合成酶的活性得到提高。

发明内容

本发明目的是提供一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌。

本发明技术方案如下：

所述谷氨酰胺合成酶来源于嗜酸乳杆菌，由基因glnA编码，在GENEBANK上的编号为3251394。本发明在谷氨酸棒杆菌基因工程菌中过表达来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶。为了保证该异源基因的表达水平，在蛋白质氨基酸序列保持不变的前提下，对该异源基因进行了密码子优化，优化前后的基因序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明的克隆载体为pUC57，该载体用来保存合成基因glnA。

本发明的表达载体为pXMJ19，该载体是大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型载体，自身包含tac启动子同时该启动子受IPTG诱导。

本发明的宿主细胞为谷氨酸棒杆菌GM34，该菌株是一株L-谷氨酰胺产生菌株。

本发明的另一宿主细胞为谷氨酸棒杆菌TP607，该菌株是一株L-色氨酸产生菌株。

本发明谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据Genbank ID：3151394，合成并优化来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA；