[发明专利]一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的LAMP‑HNB引物组、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测油菜茎基溃疡病菌的LAMP-HNB引物组、试剂盒及方法。

背景技术

油菜茎基溃疡病是油菜最严重的真菌病害之一，其致病菌为小球腔菌属的油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)，该病菌致病力强，能引起油菜茎基部发生溃烂，严重时可导致油菜减产达30％-50％，甚至更高。油菜茎基溃疡病菌在澳大利亚、加拿大、美国、欧洲等油菜主产国有发现，而在中国未见报道，属于中国进境植物检疫性有害生物。近年来，在我国出入境检验检疫机构从进口澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境油菜籽中多次截获茎基溃疡病菌L.maculans。中国油菜产区气候与澳大利亚、美国、欧洲三大州相似，且中国目前的油菜主要栽培品种高度感病。此外，随着贸易全球化，病菌传入的风险加剧。为防止油菜茎基溃疡菌的传入，建立一种准确性高、敏感性强和简便快速的检测方法将成为预防油菜茎基溃疡病传入中国的关键因素之一。

目前检测油菜茎基溃疡病菌的方法主要为荧光定量PCR和普通PCR两种方法，但普通PCR检测操作复杂且耗时长，同时需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵的实验仪器以及分子生物学专业的操作人员，适用性局限较大，而实时荧光RT-PCR技术需要昂贵的检测设备，检测成本较高，不适合基层和小型实验室推广使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种低成本、灵敏、准确、简便和快速的检测油菜茎基溃疡病菌的LAMP-HNB方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广的LAMP-HNB引物组和含有该LAMP-HNB引物组的试剂盒。

为了解决上述问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的LAMP-HNB引物组，该引物组包括外引物对和内引物对，所述的外引物对为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述的内引物对为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明第二方面提供了所述的LAMP-HNB引物组在制备检测油菜茎基溃疡病菌的产品中的应用。

本发明第三方面提供了一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的试剂盒，包括上述LAMP-HNB引物组。

在一优选例中，还包括指示剂。

在一优选例中，所述的指示剂为羟基萘酚蓝。

在一优选例中，所述的羟基萘酚蓝为来自Sigma公司的货号为H991331试剂盒中的试剂。

在一优选例中，还包括DNA聚合酶。

在一优选例中，所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

在一优选例中，所述的Bst DNA聚合酶为来自NEB公司的货号为M0538S试剂盒中的试剂。

在一优选例中，还包括等温扩增反应缓冲液、dNTPs、含有Mg²⁺的可溶性化合物。

在一优选例中，所述的含有Mg²⁺的可溶性化合物为MgSO₄。

在一优选例中，所述等温扩增反应缓冲液、MgSO₄为来自NEB公司的货号为M0538S试剂盒中的试剂。

在一优选例中，还包括阳性对照。

在一优选例中，还包括阴性对照。

在一优选例中，还包括核酸提取试剂。

在一优选例中，所述的核酸提取试剂为天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP305的DNA提取试剂盒中的试剂。

本发明第四方面提供了一种试剂盒在检测油菜茎基溃疡病菌或含有油菜茎基溃疡病菌核酸样品中的应用。

本发明第五方面提供了一种用于检测样本中的油菜茎基溃疡病菌或油菜茎基溃疡病菌核酸的方法，包括使用上述LAMP-HNB引物组或试剂盒的步骤。

在一优选例中，所述的方法还包括获得样本核酸的步骤。

在一优选例中，所述的核酸为DNA或者RNA。

在一优选例中，所述的DNA是通过采用天根生化科技(北京)有限公司的货号为DP305的DNA提取试剂盒中的方法获得。任选的，当所述的核酸为RNA时，还包括RNA反转录为cDNA的步骤。

在一优选例中，所述的方法还包括在检测样本核酸中加入LAMP-HNB反应试剂进行LAMP-HNB扩增反应的步骤。