[发明专利]一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法

说明书

本发明涉及一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，本发明采用鸡肝细胞可高效扩增J亚群禽白血病病毒，利用鸡肝细胞可以更早产生高滴度病毒的特性，缩短J亚群禽白血病病毒分离检测时间，实现提早检测到病原，提高J亚群禽白血病病毒检测方法的敏感度。在J亚群禽白血病病毒感染MOI为0.001时，ELISA检测感染维持培养3天的鸡肝细胞的效果与感染维持培养7天的DF‑1细胞相当。本发明建立发高效扩增方法的将加快J亚群禽白血病病毒的净化进程，节约时间、成本，本发明在J亚群禽白血病病毒净化检测中具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法。

背景技术

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是可引起禽类患多种肿瘤性免疫抑制疾病的反转录病毒。该病毒根据其囊膜蛋白特征可分为A-J共10个亚群，而A，B，C，D以及J亚群可引起鸡群患不同类型肿瘤的禽白血病病毒，这些病毒具有垂直和水平传播的能力。其中C，D亚群十分罕见。国内目前最常见的是J亚群，其次是A亚群和B亚群。患病鸡只常表现出产蛋率下降，消瘦，鸡只胴体废弃，鸡只死亡等，导致国内乃至世界范围内养禽业的巨大经济损失。因ALV无特效药物治疗，也没有疫苗可以使用，目前该病原的防控主要采取淘汰阳性鸡群的净化措施。ALV病毒分离鉴定的金标准是待检样品接种鸡胚成纤维细胞DF-1细胞系，维持7-9天后，以抗ALV群特异性抗原p27单克隆抗体进行间接免疫荧光(IFA)或者ELISA进行确诊。这种方法虽然可靠性高，但是耗时长。本发明利用鸡肝细胞作为ALV病毒分离细胞。与传统的DF1细胞比较，ALV在鸡肝细胞上的病毒滴度显著提高；ELISA检测时，感染的鸡肝细胞维持培养5天与DF-1细胞维持培养7天的效果相当或更佳。因此，利用能够高效扩增J亚群禽白血病病毒的鸡肝细胞作为病毒分离检测用细胞，将加快ALV的净化进程，节约时间、成本，在ALV净化检测中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种高效扩增禽白血病病毒的方法，并实现提早检测到禽白血病病毒病原。本发明利用病毒复制速率显著高于DF-1细胞的鸡肝细胞来扩增J亚群禽白血病病毒，利用鸡肝细胞可以更早产生高滴度病毒的特性，实现提早检测到病原。

本发明公开了可以高效扩增禽白血病病毒的鸡肝细胞。本发明还公开鸡肝细胞高效提高扩增J亚群禽白血病病毒的滴度，而且可以使ELISA检测分离病原时间大幅缩短，实现提早检测到禽白血病病原。

为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案是：

一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，包括以下步骤：

1)鸡肝细胞的培养；

2)鸡肝细胞高效扩增J亚群禽白血病病毒：将鸡肝细胞接种培养，在汇合度为70％时，

将J亚群禽白血病病毒接种细胞，以含2％胎牛血清的培养基培养；

3)J亚群禽白血病病毒的测定。

步骤1)中，鸡肝细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。

步骤1)中，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以0.25％的胰酶进行消化、传代至所需的细胞培养板中。

步骤2)中，将鸡肝细胞接种培养，在汇合度为70％时，将J亚群禽白血病病毒接种细胞，MOI为0.001，做两个重复，以含2％胎牛血清的培养基培养7天，每天收集200μl上清冻于-80℃冰箱备用，同时每孔补200μl含2％胎牛血清的培养基。

步骤3)中，测定收集上清的TCID₅₀；利用GraphPad Prism 5软件绘制J亚群禽白血病病毒生长曲线。

鸡肝细胞能高效扩增J亚群禽白血病病毒，病毒效价可高达1.58×10⁷TCID₅₀/ml；