[发明专利]一种卵母细胞H3K27三甲基化分析指标体系

说明书

技术领域

本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种卵母细胞H3K27三甲基化分析指标体系。

背景技术

免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织。这种技术已经广泛应用于表观遗传学调控领域。

近年来的研究显示，表观遗传学调控在细胞生长与发育中扮演着越来越重要的作用，组蛋白甲基化修饰是表观遗传学重要调控机制之一。其中，组蛋白H3 第79位赖氨酸(H3K79)的修饰对建立与维持常染色质与异染色质两种状态的调控至关重要，与细胞核的重编程密切关联。Feng等数个研究小组发现，一类新的组蛋白赖氨酸甲基转移酶DOT1可以将其催化(Q.Feng et al.,Methylation of H3-lysine79is mediated by a new family of HMTases without a SET domain,Curr Biol,12(2012):1052-1058)。而据研究，利用小分子化合物 EPZ004777(W.Y.Yu et al.,Catalytic site remodelling of the DOT1L methyltransferase by selective inhibitors,Nat Commun3(2012):1288)特异性靶向抑制组蛋白H3第 79位赖氨酸的二甲基化(H3K79me2)甲基转移酶DOT1L，在诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)的工作中，可取代Klf4和c-Myc基因显著加快重编程速度，增加iPSCs阳性克隆数量(T.T.Tian et al., Chromatin-modifying enzymes as modulators of reprogramming,Nature,483(2012) 598-602)。

在早期胚胎发育过程中，基因呈现出时空的表达模式，而在此过程中组蛋白甲基化的修饰也表现出动态学的变化，组蛋白甲基化修饰酶参与了早期胚胎发育复杂的网络调控。其中动物的体细胞克隆胚胎在发育过程中组蛋白甲基化的修饰对其发育有着重要影响。

动物的体细胞克隆，是指利用一定的设备和技术手段，将动物的体细胞与已经去除细胞核遗传物质的卵母细胞进行体外重组即体细胞核移植，接着再将克隆胚胎体外培养至特定的发育时期后，然后移植到生理状态相同的代孕母体的子宫内，完成发育，生产与体细胞供核体遗传上同质后代的过程。十几年来，体细胞克隆技术结合分子生物学和细胞培养技术生产了大量的基因修饰后代，包括外源基因的随机整合和基因定点插入、敲除的动物。借助体细胞克隆生产转基因动物，获得了远比原核注射高的效率，这在动物育种、拯救濒危动物乃至医学基础与临床研究方面具有广泛的应用价值，例如为人类器官移植开辟异源供体(L.X.Lai et al.,Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer coning,Science,295(2002)1089-1092.)、制备人类疾病医学动物模型以及生物学基础研究等提供了一个比较理想的平台。通过体细胞克隆技术还成功建立了来自克隆胚胎的小鼠、大鼠、人胚胎干细胞系，为治疗性克隆打下了坚实的基础。

体细胞克隆胚胎的体外培养是克隆动物体外生产十分重要的环节，这一步将直接关系到克隆胚胎生产的效率和质量、重构程序的优化以及早期胚胎移植等问题。为了确保体外培养的效果，实验室中所使用的培养液的成分和培养的环境(包括温度、气体浓度和湿度等)，都是尽量模拟母体生殖道的内环境。但是由于毕竟是模拟的，所以动物胚胎的体外培养体系仍不能完全模仿母体生殖道的内环境，因此胚胎体外的培养效果与体内胚的发育效果仍然有一定的差距。母体生殖道内的液体成分较为复杂，含有大量的激素和生长因子，且这些成分并非恒定的，或多或少对胚胎的后期发育有积极地调控作用，而实验室常用的培养液成分相对单一、固定，无法充分模拟母体生殖道内的液体成分，这也解释了为什么动物的克隆效率比较低的部分原因。因此，实验室内常用的培养液还需通过添加或者调节生长因子、激素等，使其能够达到最佳的模拟状态，从而使胚胎的体外培养体系进一步完善，在实验室内可以得到足够多的优质胚胎，为该动物的后期实验研究提供好的素材。