[发明专利]一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法及应用

说明书

本发明公开了一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法，并成功构建了Mdr1a/1b基因敲除大鼠模型，为研究P‑糖蛋白(P‑glycoprotein,P‑gp)的功能例如介导药物的转运提供了新的动物模型。本发明首次利用CRISPR/Cas9技术进行大鼠P‑gp的基因敲除，通过Mdr1a和Mdr1b靶点设计、sgRNA体外合成与转录、假孕鼠的准备、受精卵体外显微注射与胚胎移植等过程得到了F0代嵌合鼠，再经过两代繁殖筛选，最终得到了Mdr1a/1b双基因敲除的纯合子大鼠。经T7EI核酸内切酶验证，在所得到的基因敲除大鼠中没有出现脱靶现象。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种Mdr1a/1b双基因敲除的方法及其在Mdr1a/1b基因敲除大鼠模型构建中的应用。

背景技术

1976年，Juliano RL和LingV等人在筛选耐秋水仙碱的中国仓鼠卵巢细胞时，发现细胞膜上的一种糖蛋白能够使细胞产生交叉耐药的现象，因该蛋白与细胞膜的渗透性(Permeability)有关，故将其命名为P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。

P-gp是最早发现也是目前研究最透彻的ABC转运体，又被称为ABCB1(或MDR1)。P-gp为单链蛋白，大约含有1280个氨基酸，分子量约为170kD，是位于细胞膜上的12次跨膜蛋白，由两个相似性为43％的亚基组成，每个亚基包括1个跨膜结构域(TMD)和1个核酸结合结构域(NBD)。其中，TMD由6个α-螺旋组成，是极度疏水区，构成物质跨膜转运的通道；NBD则是极度保守的的亲水区，是ATP结合和水解的位点。P-gp最初是在肿瘤细胞中发现的，随后的研究发现它在体内分布广泛，尤其在小肠、肝脏、肾脏、血脑屏障、血睾屏障、胎盘等具有分泌作用的组织和器官中表达量较高。P-gp的主要生理作用是水解ATP产生能量，然后利用这些能量将内源性物质(胆固醇、胆酸、氨基酸、糖类、脂肪、激素以及电解质等)、外源性物质(药物及其代谢产物等)以及一些毒素排出细胞，从而起到保护细胞和组织器官的作用。然而，P-gp对药物外排无疑会降低药物的生物利用度，影响药物疗效的发挥。对早期药物研发失败的案例进行分析发现，虽然失败的原因有多种，但大约有40％的失败是由于化合物的吸收、分布、代谢、排泄(ADME)性质不佳，而导致ADME性质不佳的一个重要原因就是P-gp对药物的外排造成药物的生物利用度低。此外，研究表明，约有90％的肿瘤化疗失败是由于机体出现多药耐药，而导致多药耐药的主要原因是P-gp的过表达。基于以上两点，P-gp介导的药物转运研究非常重要。

啮齿类动物中的小鼠和大鼠是药物代谢动力学实验中最常用的动物模型，具有性情温顺、繁殖快的优点。在研究P-gp介导的药物转运包括筛选P-gp的抑制剂时，许多研究都是直接选用野生型的小鼠和大鼠，然而，由于抑制剂或抗体的特异性不高等原因，在实验中经常会出现一些难以解释的数据。基因敲除技术的出现为解决这一难题提供了可能。

最早的基因敲除技术是基于同源重组的原理，但是效率低下，而且周期很长。随着生物技术的发展，ZFN和TALEN技术先后出现，大大提高了基因敲除的效率，但其缺点是实验设计复杂、成本较高。CRISPR/Cas9是继ZFN和TALEN之后出现的第三代基因编辑技术，与ZFN和TALEN技术并称为基因编辑的三大利器，具有成本低、操作简单、靶向精度高的优点，可以实现多基因同时敲除，而且几乎没有物种限制。基于上述基因敲除技术，研究者们也成功构建了一些P-gp基因敲除的动物模型。P-gp的编码基因在啮齿类动物中有3种(Mdr1a,Mdr1b,Mdr2)，不同基因编码的P-gp扮演着不同的生理角色：Mdr1a、Mdr1b编码的P-gp与药物的跨膜转运及药物抗性有关，在药物代谢动力学中研究较多；Mdr2编码的P-gp主要负责磷脂的转运，同时可能参与激素的转运与调控。1994年，利用同源重组技术，Schinkel AH等人成功敲除了小鼠中的Mdr1a基因。1997年，在已有工作的基础上，Schinkel AH等人又构建了Mdr1b以及Mdr1a/1b基因敲除小鼠模型。2012年，基于ZFN技术，Chu X等人完成了大鼠Mdr1a基因敲除。然而，由于技术限制，基因敲除大鼠模型出现得较小鼠晚，到目前为止，还没有Mdr1a/1b基因敲除大鼠模型出现。