[发明专利]一种利用基因芯片检测结核分枝杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌检测领域，具体涉及一种利用基因芯片检测结核分枝杆菌的方法。

背景技术

结核病是常见的人兽共患细菌性传染病之一，给人类的健康以及畜牧业的发展带来了严重的危害。结核杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核分枝杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。

传统的结核病原菌检测方法有：抗酸染色法、细菌培养法。抗酸染色法简捷快速，但是灵敏度较低；培养法是检验分枝杆菌的最可靠有效的方法，但是由于分枝杆菌生长缓慢，检测周期较长，至少需要两周甚至更长的时间，难以满足进出境动物检验检疫的快速通关要求。随着分子生物学技术的不断发展及完善，国内外都已开展了基于分枝杆菌保守序列及特异序列方面的PCR检测技术研究。基因芯片技术是伴随着人类基因组计划而逐步形成的一门新技术，它是融微电子学、分子生物学、物理学、化学和计算机技术为一体的高度交叉的新科技杰作，以其高通量、微量化、污染少、可多基因多标本平行检测等特点被广泛应用于生命科学各领域。

基因芯片，又称DNA微阵列，是指将许多特定的寡核苷酸或基因片段有序的、呈一定密度的排列在玻璃片或尼龙膜等载体上所形成矩阵，将待测样品用荧光染料标记(或同位素法等)与芯片上的探针杂交，然后杂交信号用激光扫描仪检测，即可获得杂交数据，计算机分析检测结果，以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的埋制，整个流程需要由芯片制作仪、芯片扫描仪、杂交仪和PCR扩增仪和数据分析系统共同完成。

基因芯片根据探针点样的不同分为点样法和原位合成法。点样法，是根据微阵列的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后通过计算机控制的三坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙以及其它固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学的方法使之固定，该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的微阵列。原位合成法，是在玻璃等硬质表面上直接合成寡核苷酸探针阵列，目前应用的主要有光去保护并行合成法，压电打印合成法等，其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。

基因芯片以基因芯片的片基和支持物的不同可以分为无机片基和有机合成物片基，前者主要有半导体硅片和玻璃片等，其上的探针主要以原位聚合的方法合成：后者主要有特定孔径的硝酸昏维膜和尼龙膜，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上。另有以聚丙烯支持物用传统的亚磷酸胺固相法原位合成高密度探针序列。

基因芯片可以将成千上万特异的探针或DNA固定在一块芯片上，对来源于不同个体、组织(病变和正常)、细胞周期、发育和分化阶段、诱导和药物处理前后的细胞内mRNA或反转录后产生的eDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、病变特异性、组织特异性、分化发育特异性进行综合的分析、判断和比较，迅速地将基因的改变和疾病联系起来，并确定这些基因的功能。

目前，现有技术中结核分枝杆菌基因芯片存在着检测不准确、灵敏度低等问题，无法为结核病的防控提供依据。

发明内容

本发明提供一种利用基因芯片检测结核分枝杆菌的方法，以解决现有技术中结核分枝杆菌基因芯片检测不准确、灵敏度低的问题。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：

一种利用基因芯片检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤一、基因芯片制备；

步骤二、基因样品制备；

步骤三、基因芯片与基因样品杂交；

步骤四、检测杂交结果。

进一步的，步骤一中的基因芯片通过以下步骤制备：首先，用芯片点样仪将稀释好的DNA分子探针印点到固相载体上，然后，将基片放入紫外仪中进行交联至500mJ/cm²，最后用0.5％SDS清洗液清洗5-10min，纯净水清洗5-7min，低速离心或吹干后备用。