[发明专利]一种鲫鱼冠状病毒HB93的RT‑LAMP检测引物及应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲫鱼冠状病毒HB93的RT-LAMP检测引物及应用。

背景技术

国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2012年发表了最新的病毒分类第九次报告，将套式病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科(Coronaviridea)中新设冠状病毒亚科(Coronavirinea)和环曲病毒亚科(Torovirinae)。

冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒^[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。2002-2003年期间，自我国局部地区发生的非典型肺炎，即由冠状病毒属的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。

目前对冠状病毒科的研究主要集中在冠状病毒亚科，而对环曲病毒亚科研究甚少。其中，2006年鳊鱼病毒属(Bafinivirus)的中的鳊鱼病毒(White bream virus)由Schütze H等科学家在鳊鱼体内发现，这也是目前ICTV分类中确定的唯一以水生动物为宿主的冠状病毒。

目前鲫鱼冠状病毒(CrucianCarpBafinivirus,CCBV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲫鱼冠状病毒HB93的RT-LAMP检测引物，所述的引物如下：

F3：5’-ACTCGAAGGAAACATCCAT-3’；

B3：5’-CTGGGTGTGTGGTTGATG-3’；

FIP：5’-GTCGTGTTTCTTCCATTCCATAGAATCATCTTCGACCTCAGTCA-3’；

BIP：5’-GGCTGGGACAACACCAAAACACTGAGAGTTGATGTCATAGC-3’。

本发明的目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93的RT-LAMP检测引物的应用，所述的引物可用于制备检测鲫鱼冠状病毒的检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的RT-LAMP检测引物，所述的引物如下：

F3：5’-ACTCGAAGGAAACATCCAT-3’；

B3：5’-CTGGGTGTGTGGTTGATG-3’；

FIP：5’-GTCGTGTTTCTTCCATTCCATAGAATCATCTTCGACCTCAGTCA-3’；

BIP：5’-GGCTGGGACAACACCAAAACACTGAGAGTTGATGTCATAGC-3’。

一种鲫鱼冠状病毒HB93的RT-LAMP检测引物的应用，包括利用上述引物制备检测鲫鱼冠状病毒的检测试剂盒。

优选的，当制备成试剂盒时，该试剂盒的非诊断性检测方法包括：

一种鲫鱼冠状病毒HB93的RT-LAMP检测方法，步骤包括：

1)提取待测样品的RNA；

2)RT-LAMP扩增:

采用25μl反应体系：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，DTT4mM，MgCl₂ 2-10mM，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，模板RNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，选择55-65℃和30-120分钟进行RT-LAMP反应之后，80℃灭活2分钟；

3)、检测结果判定，采用下述三种方式之一：

A、发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；

B、每25μl体系的反应管加1000×SYBR Green I 1-2μl，1-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性；