[发明专利]一种登革病毒的PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域。具体地，本发明涉及一种蚊虫感染登革病毒的极早期检测方法。

背景技术

登革热(dengue fever，DF)是由伊蚊(Aedes)传播的、登革病毒(dengue virus,DENV)感染引起的人类最严重的虫媒传染病，可引起登革热(DV)、重症登革热和登革休克综合征等。尤其是以高热、严重出血、休克等为临床症状的重症登革热，病死率较高。

登革病毒自1943年首次被分离以来，已在100多个国家出现过病毒流行，全球将近一半的人口(约25亿)有罹患登革热的危险，世界卫生组织最新统计数据显示每年约5千万～1亿会发生显性感染，近3亿人会发生隐性感染，显性感染者中约50万人因重症登革热需住院治疗，其中很大一部分是儿童，某些地区的死亡率约5％。由于全球气候变暖、人口快速增长、人员流动性激增等因素，登革病毒感染的威胁正日趋严重，近几十年全球登革热发病率大幅度增长。据预测，全球50-60％的人口可能会面临威胁，登革病毒感染已成为一个世界性的严重公共卫生问题，是世界卫生组织呼吁全球预警和应对(Global Alert and Response，GAR)的疾病之一。

在我国，登革病毒的感染也较为严重，广东、广西、海南、福建等东南沿海地区是高发地区。尤其2014年，在广东等东南沿海地区出现历史上最为严重的登革热疫情，是近年来十分罕见的，约有3万多人显性感染，发病人数是常年的10倍以上，严重威胁着广东、乃至深圳广大居民的健康。由于目前尚无特效治疗手段，同时疫苗研制尚未成功，所以，在我国登革热也是一个非常严重的公共卫生问题。

登革病毒以伊蚊为传播媒介，共有四种不同的病毒毒株。目前认为：病毒的传播途径是由雌蚊叮咬带有病毒血症的登革热患者或灵长类，病毒在蚊虫体内增殖，经8-10天的潜伏期，再将病毒传播给健康人，伊蚊感染后无症状，但可终身携带和传播病毒，并可经卵传递给后代。由此可见：伊蚊在登革病毒的自然循环中处于中心的位置。所以，针对伊蚊感染登革病毒进行检测将在极早期获得疾病传播的信息，将成为控制登革病毒在人群中传播的极早期监控手段。

长期以来，登革病毒传播的极早期方法非常欠缺，对登革病毒的检测常常是疫情发生之后，即出现人群感染病例以后的检测，使得对登革病毒的检测常常处于被动和滞后的状态，常用的检测方法为：ELISA方法检测病人血清中特异性的登革病毒抗体和登革病毒抗原；PCR方法检测登革病毒的基因序列。而对于蚊虫感染登革病毒的检测方法则相对欠缺，仅仅在人感染的流行区域对蚊虫进行登革病毒基因进行PCR检测，检测基因针对登革病毒的结构基因E基因。所以，针对蚊虫感染登革病毒的检测方法尚未建立，而极早期检测方法更是未见。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：蚊虫感染登革病毒的极早期检测技术。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为提供一种登革病毒的PCR检测方法，包括如下步骤：

S1、登革病毒RNA的提取纯化：匀浆破碎蚊虫虫体和/或孑孓虫体和/或虫卵，提取全部RNA分子，采取负向选择的方法去除宿主mRNA，纯化得到登革病毒RNA；

S2、登革病毒RNA分子的逆转录：根据登革病毒不同毒株之间的共有序列，设计特异性逆转录PCR的茎环状引物，逆转录所述登革病毒RNA得到登革病毒的cDNA；

S3、实时荧光定量PCR：根据所述共有序列和所述茎环状引物，设计实时荧光定量PCR引物，利用实时荧光定量PCR的方法定量检测登革病毒的浓度。

在本发明提供的登革病毒的PCR检测方法中，所述步骤S1中，基于蚊虫mRNA具有3’-polyA、而登革病毒RNA的3’末端没有多聚polyA的特征，利用寡dT纤维素-核酸纯化柱吸附除去宿主mRNA分子，保留没有3’-polyA的RNA，利用负向选择纯化登革病毒RNA。

在本发明提供的登革病毒的PCR检测方法中，所述步骤S2中，所述共有序列为5’-ttttwawtagagagcagatctctg-3’，其中w为a或t；所述茎环状引物为：

5’-CAGAGATCTGCTCTTAWTWAAAAGTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTTTTWAW-3’。

在本发明提供的登革病毒的PCR检测方法中，针对登革病毒不同毒株基因组中5’-UTR的特征性一致序列，采用简并密码获得所述共有序列。