[发明专利]一种PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人PD-1蛋白的功能域，所述DNA序列是小鼠PD-1基因的第11053-11385位核苷酸用人PD-1基因的DNA片段进行替代，且保留包括跨膜区在内的其它小鼠PD-1区域，所述人PD-1基因的DNA片段如SEQ ID NO：21所示，该人源化小鼠PD-1基因的DNA序列含有SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的人源化小鼠PD-1基因的DNA序列，其特征在于，其CDS序列如SEQ ID NO:15所示，其编码mRNA的序列如SEQ ID NO:16所示，其编码的蛋白序列如SEQ IDNO：17所示，且功能不变。

3.权利要求1-2任一所述的DNA序列在构建PD-1基因修饰人源化的动物模型中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，将含有人源化小鼠PD-1基因的DNA序列的表达载体与Cas9mRNA，小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA质粒的体外转录产物注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD-1基因修饰人源化小鼠模型。

5.特异性靶向小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA，其靶位点序列如SEQ ID NO:3或SEQID NO:8所示。

6.根据权利要求5所示的sgRNA，其特征在于，合成序列如SEQ ID NO:3所示靶位点的上下游单链序列分别如SEQ ID NO:9-10所示；合成序列如SEQ ID NO:8所示靶位点的上下游单链序列分别如SEQ ID NO:11-12所示。

7.含有权利要求5或6所述sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。

8.权利要求5或6所述sgRNA或权利要求7所述的CRISPR/Cas9打靶载体在制备PD-1基因修饰动物模型中的应用。

9.一种制备PD-1基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1-2任一所述的人源化小鼠PD-1基因的DNA序列的部分、3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化小鼠PD-1基因第二外显子的同源重组表达载体；所述人源化小鼠PD-1基因的序列的部分如SEQ ID NO:21所示所述5’同源臂如SEQ ID NO:18所示，所述3’同源臂如SEQ ID NO:24所示；

(2)构建小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA的质粒；

(3)将步骤(2)的体外转录产物与步骤(1)的表达载体以及和Cas9mRNA注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产PD-1基因修饰人源化小鼠模型。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，是以野生型C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增5’同源臂片段和3’同源臂片段，扩增的引物对序列分别如SEQ ID NO:19-20和SEQ ID NO:25-26所示；所述质粒为PV-4G。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，步骤(2)小鼠PD-1基因第二外显子的sgRNA的质粒是将权利要求6或7所述sgRNA连接至pT7-sgRNA质粒获得。

12.一种PD-1基因修饰人源化的动物模型在制备人源化动物模型中的应用，其特征在于：所述动物为非灵长类哺乳动物，其基因组中含有人PD-1基因片段，能正常表达PD-1功能蛋白，且表达的蛋白含有人PD-1蛋白的功能域，所述人PD-1基因片段如SEQ ID NO：21所示。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述非灵长类哺乳动物为啮齿类动物。