[发明专利]一种具备双单链末端PCR产物的获得方法及其检测方法

说明书

本发明涉及一种具备双单链末端PCR产物的获得方法，包括如下步骤：(1)设计用于扩增目的核酸的正向引物F和反向引物R序列，并在正向引物F和反向引物R序列的5'端分别加上Tag1和Tag2序列，Tag1序列和正向引物F序列之间、Tag2序列和反向引物R序列之间分别用若干胸腺嘧啶隔开，合成引物Tag1‑F和Tag2‑R；(2)用紫外线对引物Tag1‑F和Tag2‑R的水溶液照射至少30min；(3)混合PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，得到具备双单链末端的PCR产物。本发明PCR产物的检测，不需要对引物进行额外的修饰，同时还省去了电泳等繁琐的操作步骤，使PCR产物的检测变得方便快捷，可提高检测效率，降低成本，尤其适用于实时检测或偏远地区使用。

技术领域

本发明属于核酸技术领域，具体涉及一种具备双单链末端PCR产物的获得方法及其检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR技术通过将模板核酸在高温(95℃)时变性成单链，在降温后(降至50℃-60℃)引物与模板根据碱基互补配对特异性结合；在最适延伸反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶以5'-3'的方向合成互补链的反应。整个反应由高温变性、低温退火及适温延伸组成的循环反应进行。一个循环需2～4分钟，2～3小时使目的DNA得以迅速扩增，将待扩目的基因扩增放大几百万倍。因PCR技术特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点而被广泛应用。不仅常被用于核酸的基础研究，PCR技术也是目前核酸检测的金标准，在医学、生物工程等领域应用广泛。PCR产物是具有平末端的双链DNA，一般包括通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行分离，随后需要借助染色和紫外透射成像进行分析。上述操作步骤繁琐、耗时长，且依赖仪器及特殊训练的专业人员，不适用于高通量、快速的PCR产物检测。

利用核酸试纸条进行检测的技术是一项检测PCR产物的新技术，该技术一般需要对PCR引物序列进行双修饰或者其他特殊的处理：一、双修饰引物：为了在试纸条上进行夹心法检测都需要进行双修饰常用于标记的小分子有Biotin，Digoxin，FITC，Cy3等，。这些小分子都是修饰在引物的末端，当引物与模板退火延伸时，小分子也被掺入到在产物末端，从而达到标记PCR产物的目的。例如Wansika等在检测黑斑综合征和白斑综合征病毒核酸时，在两条引物上分别标记Biotin和FITC，因此链霉亲和素(SA)包被的胶体金可以通过SA与Biotin的高亲和力作用而捕获带Biotin-Tag的扩增产物。由于在试纸条的T线区域事先划有FITC的抗体，通过FITC抗体与抗原的特异性作用而将带有FITC-Tag的产物固定在T线区域，实现了对病毒核酸的快速检测。这种修饰虽然可以实现快速检测，但是需要对引物进行双标记，增加了检测的成本。二、双修饰加高温变性处理：PCR扩增产物一般都是平末端双链，如果不在末端进行分子修饰的话，则没有突出的粘性末端用于杂交；高温变性可以将双链分离而得到单链，通过与被标记在纳米粒子表面的核酸互补配对而固定到纳米粒子表面。例如Despina等利用彩色聚苯乙烯纳米微球标记上Poly T作为Tag，用于捕获带Poly A的目的核酸序列，用于快速灵敏地检测玉米IVR基因(图1)。IVR的PCR双链片段高温变性成单链后，与带有Poly A的短链核酸杂交，形成带Poly A尾巴的双链片段，最后加入Poly T聚苯乙烯纳米微球将其捕获；由于事先在PCR的primer上修饰了Biotin(生物素)，通过Biotin和T线区域的SA高亲和力形成纳米微球-PCR产物-SA复合物，在T线区域形成可视化条带。这样通过双重化学修饰再加上高温变性才能用试纸条进行夹心法检测，成本高且需要高温变性来产生单链，效率低，影响检测灵敏度。