[发明专利]一种具备双单链末端PCR产物的获得方法及其检测方法

权利要求书

1.一种具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）设计用于扩增目的核酸的正向引物F和反向引物R序列，并在正向引物F和反向引物R序列的5'端分别加上Tag1和Tag2序列，Tag1序列和正向引物F之间、Tag2序列和反向引物R之间分别用6-10个胸腺嘧啶隔开，合成引物Tag1-F和Tag2-R；

（2）用波长100～290 nm的紫外线对引物溶液Tag1-F和Tag2-R照射至少30min；

（3）混合PCR反应体系置于PCR仪中进行反应，得到具备双单链末端的PCR产物。

2.根据权利要求1所述的具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，步骤（1）中6-10胸腺嘧啶的两端分别各加一个腺嘌呤或胞嘧啶。

3.根据权利要求1或2所述的具备双单链末端PCR产物的获得方法，其特征在于，Tag1和Tag2序列分别为：

Tag1：5’-CTGTACGAGACT-3’

Tag2：5’-TCTAATGCTGAT-3’。

4.权利要求1-3任一所述具备双单链末端PCR产物的非疾病的诊断和治疗目的的检测方法，其特征在于，可选择以下两种方法中的任一种：

（一）直接法：分别设计并合成与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，并分别在C-Tag1和C-Tag2的3'端用巯基修饰；将修饰过后的C-Tag1和C-Tag2分别通过金硫键结合到胶体金粒子上，得到AuNP DNA1和AuNP DNA2；将AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比0.8-1.2:0.8-1.2混匀制备成红色透明的标记胶体金溶液；将PCR产物加入到标记胶体金溶液中混匀，肉眼观察进行检测及判断，标记胶体金溶液无变化则检测结果为阴性，标记胶体金溶液变浑浊则检测结果为阳性；

（二）试纸条法：分别设计并合成与Tag1和Tag2互补的序列C-Tag1和C-Tag2，C-Tag1的3'端用巯基修饰，合成Tag1序列；将修饰后的C-Tag1通过金硫键结合到胶体金粒子上，得到AuNP DNA1，并将AuNP DNA1喷在胶体金试纸条的金标垫上；将C-Tag2序列固定在试纸条的检测区；将Tag1序列固定在试纸条的质控区；将PCR产物滴加到试纸条的样品垫，滴加上样缓冲液，等待观察结果。

5.根据权利要求4所述具备双单链末端PCR产物的非疾病的诊断和治疗目的的检测方法，其特征在于，方法（二）中上样缓冲液为：4×SSC，pH 7.0。

6.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括试纸条和/或标记胶体金溶液，以及引物；

所述引物为正向引物F和反向引物R序列，并在正向引物F和反向引物R序列的5'端分别加上Tag1和Tag2序列，Tag1序列和正向引物F之间、Tag2序列和反向引物R之间分别用6-10个胸腺嘧啶隔开，合成引物Tag1-F和Tag2-R；

所述试纸条依次包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫模块，每相邻的两模块部分重叠，硝酸纤维素膜上依次设置有检测区和质控区；其PCR的正向引物F和反向引物R序列的5'端分别加上Tag1和Tag2序列，Tag1序列和正向引物F序列之间、Tag2序列和反向引物R序列之间分别用6-10胸腺嘧啶隔开；将Tag1的互补序列C-Tag1与胶体金制备成核酸-金标记物AuNP DNA1，并将AuNP DNA1喷在金标垫上；将与Tag2互补的序列C-Tag2固定在检测区；将Tag1序列固定在质控区；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫都固定在PVC板上；

所述标记胶体金溶液由AuNP DNA1和AuNP DNA2按C-Tag1和C-Tag2摩尔比0.8-1.2:0.8-1.2混和而成；所述AuNP DNA1和AuNP DNA2分别为表面修饰C-Tag1和C-Tag2的胶体金粒子。

7.根据权利要求6所述核酸检测试剂盒，其特征在于，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫模块分别组装在PVC板上，每相邻的两模块重叠1-3 mm；将组装好的试纸条切割成2-5 mm宽。