[发明专利]人乳球蛋白mRNA核酸检测试剂盒（PCR‑荧光探针法）

说明书

技术领域

本发明涉及一种人乳球蛋白mRNA核酸检测试剂盒在体外诊断试剂中检测人乳球蛋白mRNA表达量上的应用。

背景技术

在全世界危害妇女的肿瘤疾病中中乳腺癌是第一位的恶性肿瘤，每年全世界约有200万妇女发生乳腺癌，其中有80万妇女死于乳腺癌。在世界各地之间，女性乳腺癌的发病率存在显著差异，20世纪70年代前以美国和北欧为高发地区，东欧和南欧以及南美其次，亚洲的发病率最低。但从20世纪后开始亚洲地区的发病率出现明显上升趋势，其中以我国的沿海城市最为显著，如上海乳腺癌的标化发病率在70年代初和2010年后相比增加了近2.5倍。全世界乳腺癌年均发病率依然呈逐年增加的趋势。近20年来，乳腺癌的发病率在我国也处于总体上升趋势。从2000年后，乳腺癌是我国妇女的第3死亡原因，仅次于胃癌等消化道肿瘤。

现今，乳腺癌依然是人类健康的重大威胁。目前, 手术切除、化疗、放疗及内分泌治疗依然是乳腺癌的治疗的主要方法。在上述技术已经达到相当成熟和普及的同时，高复发和转移率也依然是乳腺癌患者面临的主要问题，这些问题的出现对患者的有效生存期起着重要的影响，严重危害着肿瘤患者术后的生活质量。那么如何在患者术后检测其肿瘤的复发和转移成了众多学者的研究课题。2000年以后，很多学者都在研究将分子生物学领域应用到人类健康课题上来，至今已经十几年，由此而发展的体外检测技术也在不断成熟和完善中。其中TaqMan荧光定量PCR就是其中的一种体外诊断技术。

由于TaqMan荧光定量PCR具有重复性好，结果准确可靠的特点，所以在医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题可以以此解决。一般来说细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但仅限于组织的病理检测。由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率仅为1%。后期的免疫组织化学方法提高了检出率，但该技术生产复杂，且需要特异性的抗体，而且假阳率也高。TaqMan荧光定量PCR与这些技术相比，有着明显的优点，由于有些肿瘤可转录特异性mRNA，但无相应蛋白合成，故荧光定量PCR应用范围较蛋白广泛；另外只要知道待测基因序列，即可设计合成引物探针进行逆转录及扩增，操作方便；同时该方法具有较高的灵敏度及可重复性，保证了医学检测结果的准确性。

以人乳腺球蛋白mRNA检测为例，乳腺球蛋白mRNA是乳腺癌的特异性的生物标志物，是原发性乳腺癌特异性较高的肿瘤相关抗原，在健康人外周血细胞中检测不到人乳球蛋白 mRNA，而在复发和转移的乳腺癌患者中，如果癌细胞脱落于血液中便可以检测到。与此同时，TaqMan荧光定量PCR技术具有很好的灵敏性和特异性，有针对性的对乳腺癌患者外周血及肿瘤组织﹑骨髓等样本中的人乳球蛋白的mRNA的表达进行检测，便可以对乳腺癌细胞血行播散等诊断提供重要的依据。所以该技术的应用，将会对早期寻找乳腺癌患者血循环中的肿瘤细胞，发现乳腺外微小转移对于指导临床治疗、改善患者预后产生极为重要的作用。

发明内容

本发明为一种人乳球蛋白mRNA核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）, 含有9种组分，分别为：红细胞裂解液（10×）、无RNA酶的水、反转录缓冲液、PCR缓冲液、逆转录酶、阳性质控品、阴性质控品、RNA提取液、2×10⁶copies/µl参考品主要成份组成。

其中红细胞裂解液（10×）为Nacl，Tris-Hcl，MgCl₂.6H₂O配制溶液。

无RNA酶的水为DEPC-H₂O。

反转录缓冲液和逆转录酶为TaKaRa宝生物反转录试剂盒配制溶液。

PCR缓冲液含有为invitrogenPCR缓冲液，检测探针，上下游引物混合液。

RNA提取液为Invitrogen Trizol原液。

2×10⁶copies/µl参考品为含有目的片段的质粒。

检测用引物：上游引物：5’—GGCTTCCTTGATCCTTGCCA—3’

下游引物：5’—CTCCAATAAGGGGCAGCCAG—3’

荧光探针序列：5’—FAM—ACTGAACACCGACAGCAGCAG—TAMRA—3’

标准品序列（含酶切位点）：