[发明专利]一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母及表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母及表达方法。

背景技术

溶菌酶(lysozyme)又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，专一的破坏细菌细胞壁中肽聚糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，从而使细胞壁破裂而溶解细菌。溶菌酶是一种蛋白质类的抗菌酶，它不同于抗生素，在杀死致病菌的同时不易产生耐药性，因此正逐步发展成为新型的抗生素替代品。

乳酸克鲁维酵母是一种优秀的畜禽用益生菌，可分泌多种消化酶类，促进动物肠道健康，同时乳酸克鲁维酵母营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广、分泌蛋白能力强,不产生内毒素，是一种安全级的微生物。同时超强的分泌能力使得乳酸克鲁维酵母已成功地应用于多种蛋白的表达，相比其它酵母，乳酸克鲁维酵母拥有诸多优点，如良好的大规模发酵特性、超强的整合表达能力等,其做为表达系统已显示出巨大的潜力。

发明内容

本发明其目的就在于提供一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母及表达方法，具有工艺简单、易操作的特点。

为实现上述目的而采取的技术方案是，

一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母，所述乳酸克鲁维酵母为GG779。

一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母的表达方法，包括以下步骤：

（1）以乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化并合成猪溶菌酶基因，基因两端同时引入NcoI 与EcoRI两个限制性内切酶位点；

（2）使用NcoI 与EcoRI同时对该基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2进行双酶切；

（3）回收酶切产物，4℃连接过夜，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中；

（4）PCR扩增鉴定疑似阳性转化子并测序，同时提取疑似阳性转化子的质粒进行双酶切鉴定，得到正确的重组质粒；

（5）提取重组质粒lys- pKLAC2并使用SacII酶切线性化，线性化的重组质粒转化乳酸克鲁维酵母GG779,经PCR扩增鉴定，获得重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779。

有益效果

与现有技术相比本发明具有以下优点。

本发明与现有技术相比具有工艺简单、易操作的特点。

附图说明

以下结合附图对本发明作进一步详述。

图1为猪溶菌酶基因与pKLAC2质粒连接的阳性克隆子电泳图（引物LYS-F和LYS-R，产物约420bp）；

图2为乳酸克鲁维酵母GG779表达LYS蛋白的western bolt图（蛋白大小在15KD左右）；

图3为pKLAC2质粒图谱；

图4为pKLAC2质粒的多克隆位点图谱。

具体实施方式

一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母，所述乳酸克鲁维酵母为GG779。

包含权利要求1所述猪溶菌酶基基因的质粒，所述质粒为乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2。

所述猪溶菌酶基因是按乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化并合成的。

一种表达猪溶菌酶基因的乳酸克鲁维酵母的表达方法，如图1-4所示，包括以下步骤：

（1）以乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化并合成猪溶菌酶基因，基因两端同时引入NcoI 与EcoRI两个限制性内切酶位点；

（2）使用NcoI 与EcoRI同时对该基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2进行双酶切；

（3）回收酶切产物，4℃连接过夜，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中；

（4）PCR扩增鉴定疑似阳性转化子并测序，同时提取疑似阳性转化子的质粒进行双酶切鉴定，得到正确的重组质粒；

（5）提取重组质粒lys- pKLAC2并使用SacII酶切线性化，线性化的重组质粒转化乳酸克鲁维酵母GG779,经PCR扩增鉴定，获得重组乳酸克鲁维酵母lys- pKLAC2-GG779。

实施例1

猪溶菌酶基因合成

NCBI上发表的猪源溶菌酶序列（ACCESSION：P12069），去掉上游18氨基酸信号肽即为所需表达的成熟肽序列（序列表中序列1），在序列上游添加6个组氨酸的核苷酸序列，以便于后期纯化重组蛋白，通过乳酸克鲁维酵母的密码子偏好性表进行密码子优化，并在其上下游分别设计NcoI 与EcoRI两个限制性内切酶位点及其保护性碱基，对优化好的序列进行人工合成。序列如序列表中序列2所示。

序列1