[发明专利]CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及基于金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9(CRISPR/SaCas9)系统特异性敲除人CXCR4基因的方法，以及用于特异性靶向人CXCR4基因的sgRNA。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)归属于逆转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种，又称为艾滋病毒，其感染引起的获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)又称艾滋病，是一种危害性极大的传染病。自发现的三十多年来，AIDS已累计导致两千余万人死亡，一直是一个巨大的公众健康难题，影响着全球3,530万人的生活。

HIV可分为HIV-1和HIV-2两种亚型，HIV-1的致病力强，是引起艾滋病的主要病原体。CD4+T细胞是HIV-1病毒感染过程的首要靶点。随后研究又发现仅有CD4分子并不能介导HIV-1病毒的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体(coreceptor)。1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1病毒感染的辅助受体。T细胞向性X4HIV-1使用CD4和CXCR4进入细胞，而巨噬细胞向性R5HIV-1使用CD4和CCR5。双向性的毒株能使用CXCR4和CCR5作为共受体。其他趋化因子受体中的CCR3、CCR2、CCR8、CXCR6、CXCR7、CX3CR1能作为更限制亚群的HIV株的共受体发挥作用。

目前对艾滋病的治疗手段主要是控制HIV-1病毒的感染以及阻碍AIDS的发展，称为高效抗逆转录病毒治疗法(highly active antiretroviral therapy，HAART)，包括一系列抑制病毒各个繁殖阶段的化合物。HAART是能很大程度上减少细胞内病毒的繁殖和血浆病毒血症的发生，但对于新的宿主细胞不被HIV-1感染没有作用。为了从源头上预防健康的细胞被HIV-1感染，新的治疗方案需要彻底地破坏病毒的入侵途径，因而以CCR5和CXCR4为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等。如SDF-1(CXCR4的天然配体)以及CCR5的CCL3、CCL4、CCL4-L1和CCL5配体能够抑制不同株HIV-1引起的细胞融合和感染。

尽管辅助受体拮抗剂可有效预防HIV-1感染，遏制艾滋病的流行，但是此类抑制剂的发展也面临着挑战。长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-1产生耐药性。随着耐药性的不断出现，使得现有的抗HIV-1药物难以达到理想的治疗效果。因此，从基因组层面失活CCR5或CXCR4具有重要的治疗价值。

2008年，Sangamo成功的利用Engineered zinc finger nucleases(ZFNs)在CD4+T细胞上实现CCR5的敲除。如今这项名为SB-728-T的项目已被尝试应用于HIV感染人群的基因治疗，并已进入临床二期阶段。这一基因编辑产品通过敲除分离到病人的CD4+T细胞的CCR5，然后自体回输到病人，可以用于HIV感染的治疗。但如前面所提及的CCR5受体是巨噬细胞向性R5HIV-1的主要共受体，而T细胞向性X4HIV-1的主要共受体是CXCR4，敲除CCR5并不能治疗被双向性HIV-1感染的患者或者被T细胞向性X4HIV-1感染的患者。因此，通过基因层面敲除CXCR4在X4-向性和双向性HIV感染的患者中扩展此类治疗有明确的医学需求。