[发明专利]用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用

说明书

技术领域

本申请涉及禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。

背景技术

自1996年H5N1高致病性禽流感在我国广东地区发生以来，该病毒所感染的宿主范围越来越广，包括了很多的鸟类、哺乳动物甚至人类。H5N1病毒不仅给许多国家的养禽业带来了沉重打击，同时也向全人类的健康提出了严峻挑战。2004年开始，韩国、越南、中国、日本等多个亚洲国家相继发生高致病性H5N1亚型禽流感疫情。此后，病毒扩散范围逐步扩大，欧洲、中东及非洲地区也相继出现疫情，目前该亚型病毒已传播到全世界范围内的60多个国家。1997年，被认为只局限于禽类宿主中存在的H5N1亚型禽流感病毒，却造成了人类的感染并能够引起死亡，这也是全世界首例不需要中间宿主而使人直接感染禽流感病毒的事件。此后人感染H5N1亚型流感病例时有发生，截至2017年2月14日，H5N1亚型禽流感病毒已在全世界范围内16个国家造成共856例感染病例，其中死452例。虽然目前H5N1禽流感病毒还没有获得在人与人之间的高效传播的能力，但是病毒表面HA基因不断变异，内部基因频繁重组，大大加快了该病毒的遗传进化和传播扩散，使其宿主范围不断扩大的同时对人类的安全威胁也越来越大。H5亚型高致病性禽流感病毒除了H5N1亚型之外，还存在多种其他NA亚型病毒，目前我国H5亚型高致病性禽流感呈现了H5N1、H5N2、H5N6和H5N8等多个血清亚型的毒株同时在禽群中流行的特点。2014年以来我国H5亚型高致病性禽流感主要流行的亚型为H5N6亚型，2014年我国四川也出现了首例人感染H5N6亚型禽流感病例。H5亚型禽流感病毒的基因型也不断发生着变化，从早期的0分支发展进化为目前多分支同时存在的局面，我国当前主要流行2.3.4.4分支和2.3.2.1分支毒株，每个进化分支又分化为多个小分支，这为H5亚型禽流感病毒的早期检测和防控带来挑战。

重组酶聚合酶核酸扩增技术RPA(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，RPA能够在15分钟内进行37℃-42℃常温的单分子核酸扩增。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，其扩增原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前尚没有H5亚型禽流感病毒的RPA检测研究和报道。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’

Seq ID No.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’

Seq ID No.3：

5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAG TG-3’

Seq ID No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。

需要说明的是，在荧光检测中，探针是特异性的结合到双链的其中一条链的，只要PCR扩增的时候，将结合的探针破坏，即可产生荧光信号，因此，可以采用Seq ID No.3所示序列的探针结合到其中一条链上，也可以采用Seq ID No.3所示序列的反向互补序列作为探针结合到另一条链上，探针的修饰方式不变。