[发明专利]用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用

权利要求书

1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’

Seq ID No.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’

Seq ID No.3：

5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTG-3’

Seq ID No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3 Spacer。

2.根据权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在H5亚型禽流感病毒检测中的应用。

3.根据权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在制备H5亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。

4.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂。

5.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由RT-RPA反应缓冲液29.5μL、10μM的上游引物2.1μL、10μM的下游引物2.1μL和10μM的探针0.6μL组成；所述上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列，并且，Seq ID No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3 Spacer。

6.一种用于H5亚型禽流感病毒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取待测样品的核酸；

(2)采用权利要求5所述的试剂盒，向所述混合试剂中加入步骤(1)提取的核酸，再加入DEPC水和醋酸镁，配制成反应溶液；

(3)将步骤(2)配制的反应溶液，在40℃恒温反应，整个反应过程采集荧光信号。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述40℃恒温反应具体包括，先将步骤(2)配制的反应溶液，在40℃保温5min，然后取出装反应溶液的PCR管上下轻轻颠倒数次，瞬时离心，再继续40℃下反应15min，整个反应过程采集荧光信号。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述采集荧光信号的过程中，FAM荧光通道光源强度设置为11％。

9.根据权利要求6-8任一项所述的检测方法，其特征在于：还包括，采集40℃恒温反应前5min各点荧光值，计算其平均值，作为第一荧光值；采集40℃恒温反应5min后任意时间点的荧光值，作为第二荧光值；根据荧光增量判断待测样品为阳性或阴性，具体的，荧光增量大于55％，且持续的时间超过2分钟，判为阳性，否则判为阴性；

荧光增量＝[(第二荧光值-第一荧光值)/第一荧光值]×100％。

10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)提取待测样品的核酸，采用MagMAX^TM-96 Viral RNA Isolation Kit磁珠提取试剂盒，或者Trizol核酸抽提法。