[发明专利]一种肿瘤组织块深低温冷冻方法

说明书

一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，涉及一种肿瘤组织冷冻方法。是要解决现有的组织冻存方法导致复苏后肿瘤细胞活性显著降低，成瘤率低的问题。方法：一、冻存液的配制；二、组织块的处理及冷冻；三、冻存肿瘤组织块复苏。本发明利用渗透性和非渗透性冻存保护剂结合的方法进行肿瘤组织冻存，同时对试剂的配制比例进行优化，使冻存液中DMSO的比例降低到2％，降低了组织细胞毒性，对冻存后的组织起到很好的保护作用，使其复苏后具有较高的小鼠成瘤性，成瘤率达到90％以上。本发明用于肿瘤组织冷冻。

技术领域

本发明涉及一种肿瘤组织冷冻方法。

背景技术

肿瘤表面标志物是肿瘤细胞生长过程中产生的一种特异性物质，或因细胞病变而过 量表达的细胞成分，病理诊断及分型可为肿瘤治疗提出合理化方案，因此在改变治疗方案时，应参考已有病理结果或重新进行其他方面的病理检测分析。目前研究的肿瘤治疗 性疫苗很多，在临床研究活跃，至2017年1月，美国ClinicalTrials.gov网站已登记有1862 项临床研究，其中中国共有71项。能够在体内介导强烈的抗肿瘤效应的治疗型疫苗主要 包括：1)重组的肿瘤相关抗原(TAA)，有短的合成多肽的组合或全长的蛋白，前者需 结合到抗原提呈细胞APC表面的MHC分子上，直接提呈给T细胞，后者需被APC摄取 加工后再提呈；2)肿瘤细胞或其裂解物，其中含有TAA或与伴侣分子(如热休克蛋白) 复合的TAA；3)编码TAA的载体疫苗，包括裸DNA、RNA和病毒为载体；4)树突状 细胞(dendritic cell，DC)为基础的疫苗，包括体外荷载TAA融合蛋白的DC。

低温保护剂的种类按照是否能渗透到细胞内通常将其分为渗透性和非渗透性两种。 渗透性保护剂主要有二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙二醇等等。其特性在于保护剂的小分子结构在溶液中易结合水分子发生水合作用，增加溶液的黏性，从而在降温的过程中 减缓水分子结晶形成，减小“胞内冰晶损伤”，来达到保护细胞、组织的目的。非渗透性冷 冻保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉等等。乙烯吡咯烷酮、 羟乙基等为大分子非渗透性物质，虽能溶于水但不能自由进出细胞，其加入到溶液后可 以使溶液呈过冷状态，抑制冰晶形成。可以使特定温度电解质的浓度降低，减小溶质损 伤，并通过改变渗透压引起细胞脱水减小胞内冰晶形成，从而起到保护作用。在降温过 程中，此类保护剂主要与渗透性保护剂联合使用，促使细胞完成脱水，同时可以减少渗 透性保护剂的使用浓度来减少毒性损害。复温时，其可以提供一个高渗透压的环境，防 止过多水分进入细胞太快而引起细胞膨胀损伤。白蛋白也是一种常用的非渗透性抗冻剂。

目前，研究者们仍在不断的研究动物细胞和组织的冻存方法及冻存技术，从种类繁 多的保护剂中挑选最优保护剂的种类并研究其配比浓度以及导入、洗脱方法。降温前要将保护剂导入到组织内，复温后需要将其洗脱出来，在导入、洗脱过程中，由于细胞膜 外溶液浓度的变化造成细胞脱水或肿胀超过一定限度时，会造成组织不可逆损伤，因此 在深低温保存过程中，保护剂的导入和洗脱对组织细胞活性起着重大作用。目前研究中， 冻存较多的为质地柔软的卵巢癌、结肠癌等肿瘤组织、脂肪组织及脐带华通氏胶组织， 冻存液主要为DMSO、胎牛血清及培养基按不同配的比混合液，该方法冻存的肿瘤组织 一般在冻存半年后细胞活性即开始出现显著降低现象，主要表现为成瘤率低，仅为 50％-70％。这就限制了有计划地进行经常研究及临床应用，因而有必要寻找一种能长期 保存新鲜标本并保持其生物学特性的方法，从而实现不同质地肿瘤组织的高活性。

发明内容

本发明是要解决现有的组织冻存方法导致复苏后肿瘤细胞活性显著降低，成瘤率低的 问题，提供一种肿瘤组织块深低温冷冻方法。

本发明肿瘤组织块深低温冷冻方法，包括以下步骤：

一、冻存液的配制：