[发明专利]一种检测伊氏锥虫的引物对及其检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于寄生虫分子检测技术领域，更具体地，涉及一种检测伊氏锥虫的引物对及其检测方法和试剂盒。

背景技术

在自然界中，伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）是一种呈全球性分布的寄生原虫，借助吸血昆虫在马、牛、骆驼等家畜中进行传播，引起苏拉病（Surra），该病临床表现为进行性消瘦、贫血、黄痘、高热、心机能衰退等，严重时可造成家畜死亡，使畜牧业造成严重损失。在我国，伊氏锥虫感染水牛等家畜的概率达到10%。因此有必要对其进行锥虫早期感染的监测，并进行药物治疗。

由于伊氏锥虫与其他家畜血液寄生锥虫，特别是亲缘关系较近的布氏锥虫（Trypanosoma brucei）在形态和分子特性上非常相似，很难通过显微镜观察和常规的分子标签进行鉴定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有伊氏锥虫检测技术方面存在的缺陷和不足，提供一种检测伊氏锥虫的引物对。所述引物对能够快速准确的将伊氏锥虫从其他锥虫以及利什曼原虫（Leishmania spp）中鉴定出来，不需要昂贵的显微镜和专业的病原学知识，检测快速方便，可用于动物锥虫感染的检测和混合感染的鉴定，有利于开展流行病学调查，预防和控制伊氏锥虫的传播。

本发明的目的是提供一种检测伊氏锥虫的引物对。

本发明的再一目的在于提供一种检测伊氏锥虫的方法。

本发明的再一目的是提供含有所述引物的检测试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种检测伊氏锥虫的引物对，包含上下游引物PAG3-F和PAG3-R，其序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示：

上游引物PAG3-F：5’-GTTTGACACCGTGGAGTT-3’（SEQ ID NO.1）；

下游引物PAG3-R：5’-AACAGCCACAAACAACCC-3’（SEQ ID NO.2）。

由于PAG3（procyclin associated gene 3）基因在伊氏锥虫中部分特异缺失，与其它的锥虫在该基因上表现出序列差异，因此本发明通过伊氏锥虫PAG3基因特异性设计PCR引物对和PCR反应程序，从而实现对伊氏锥虫的快速鉴定。

所述PCR引物可用来特异性检测鉴定待测样品中是否含有伊氏锥虫；或用于鉴定伊氏锥虫；因此，所述引物对PAG3-F和PAG3-R在检测和/或鉴定伊氏锥虫中的应用，以及在制备伊氏锥虫检测试剂或试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

一种检测/鉴定伊氏锥虫的方法，所述方法具体包括如下步骤：

S1.提取待测样品DNA或血液溶解液；

S2.以步骤S1所述DNA或血液溶解液为模板，以PAG3-F和PAG3-R为引物进行PCR扩增反应；

S3.将扩增产物电泳检测，若扩增出单一250bp大小的条带，则待测样品中含有伊氏锥虫，反之则待测样品中没有伊氏锥虫。

优选地，所述PCR扩增反应体系为：引物PAG3-F和引物PAG3-R，100 ng 样品DNA或5 μL样品血液溶解液，2.5 Units EasyTaq DNA polymerase，10×Easy Taq Buffer(1×)、0.2 mM dNTPs、灭菌双蒸水补齐至25 μL，引物PAG3-F和引物PAG3-R在反应体系中的终浓度分别为0.2 μM。

更优选地，所述PCR反应体系为：100ng/μL DNA 1μL或血液溶解液5μL，10μM PAG3-F 0.5μL，10μM PAG3-R 0.5μL，10×Easy Taq Buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，5 Units/μLEasyTaq DNA polymerase 0.5μL，灭菌双蒸水补充至25μL。

优选地，所述PCR扩增反应条件为：94℃ 3 min；94℃30 s，65℃10 s，共30个反应循环；

此外，上述伊氏锥虫检测引物对PAG3-F和PAG3-R及其检测放在在制备伊氏锥虫检测试剂或试剂盒中的应用亦在本发明保护范围内。

同时，本发明还提供一种伊氏锥虫检测试剂盒，所述试剂盒包含伊氏锥虫检测引物对PAG3-F和PAG3-R。