[发明专利]特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用。

背景技术

ZFN、TALEN和CRISPR基因打靶技术是基因编辑的核心技术，相比于前两种技术繁琐的构建程序，比如每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，并且高度依赖目标上下游序列，CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的sgRNA的引导，sgRNA区可以由一系列针对不同基因的多个sgRNA组成，每个针对特异位点的sgRNA只有二十个碱基，整个载体较小，CRIEPR载体更加容易构建，其基因编辑也更加高效。

CRISPR/Cas9原是细菌和古细菌应对外源病毒侵害的防御系统，现已广泛应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、水稻等进行基因改造。它由导向序列sgRNA和核酸酶Cas9两种元件组成，sgRNA可通过碱基互补识别基因组中特定序列从而引导核酸酶Cas9对其进行切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks，DSB)，当宿主细胞通过非同源重组方式进行修复，发生非同源重组末端连接(Non-homologous endjoining，NHEJ)，就可能造成移码突变(frame shift mutation)，导致基因沉默(Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science.Cong et al.2013)。

这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，但是，随后的研究发现，该系统也存在一定的局限性，就是在非目标区域会产生DNA的突变即脱靶效应，这在一定程度上阻碍了该技术的广泛应用(High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology.Fu et al，2013；High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak et al，2013)。麻省理工学院张峰团队使用双切刻技术将Cas9的特异性提高了50倍以上，稳固了Cas9在基因打靶技术领域的地位(Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9for enhanced genome editing specificity.Cell.Ran et al，2013)。借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等领域都将得到迅猛的发展。精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性沉默目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性沉默。因此，设计、制备出特异性靶向目标基因序列的sgRNA成为了CRISPR-Cas9基因沉默技术的关键。

拟南芥基因ILK2编码蛋白属于整合素连接蛋白激酶家族，具有丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶活性。能与MAPK、PKB、GSK3等多条信号通路和细胞骨架蛋白相互作用，参与调控细胞周期G1/S/G2期，抑制细胞凋亡等过程。在拟南芥中相关家族蛋白参与多种生物与非生物逆境，在介导细胞内环境稳态和植物免疫等方面有重要作用(The Raf-like Kinase ILK1 and the High Affinity K⁺ Transporter HAK5Are Required for Innate Immunity and Abiotic Stress Response.Plant physiology.Elizabeth et al，2016)。因此，在基因组水平上对拟南芥整合素连接蛋白激酶家族相关基因进行敲除或修饰，有助于解析相关基因的功能，为农作物抗性育种提供理论支持和实践参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异靶向拟南芥整合素连接蛋白激酶家族基因ILK2的sgRNA导向序列及其应用。本发明利用编码这种sgRNA序列的DNA构建植物表达载体，该表达载体能够表达出这种sgRNA，这种sgRNA能够特异性地识别拟南芥ILK2基因。本发明还利用这对sgRNA引导Cas9核酸酶(即Cas9切割酶)对拟南芥ILK2基因进行准确、高效地靶向修饰。

具体地，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：