[发明专利]三维肺微组织模型的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种三维肺微组织模型的构建方法及应用。

背景技术

自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬的异常会导致癌细胞的出现。而一些外源物质，如纳米粒、环境污染物、药物等会引发人体内不同程度的细胞自噬。

目前对外源物质引发细胞自噬的检测均是基于二维单一细胞的检测，但是体外二维细胞由于细胞极化，缺乏细胞-细胞和细胞基质间的相互作用，其评价结果往往不能外推关联到体内，在组织层面上仍无法实现细胞自噬的体外研究。因此亟需寻找一个体外类组织模型，在三维状态下，快速有效观察待测物引发的自噬效应。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种三维肺微组织模型的构建方法及应用，采用本发明的方法所构建的三维模型，可直观检测外界物质引发的自噬效应情况。

本发明提供了一种三维肺微组织模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)使用荧光蛋白分别标记LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后均匀共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；

(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；

(3)将步骤(2)得到的载细胞凝胶微球培养14-28天，得到三维肺微组织模型。

进一步地，在步骤(1)中，LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞在荧光蛋白标记后，肺巨噬细胞与肺上皮细胞为不同颜色。用两种颜色可区分肺巨噬细胞和肺上皮细胞。LC-3为自噬相关标志物。

进一步地，在步骤(1)中，使用绿色荧光蛋白标记LC-3的肺巨噬细胞，使用红色荧光蛋白标记LC-3的肺上皮细胞。

进一步地，绿色荧光蛋白为GFP、EGFP或sfGFP蛋白；红色荧光蛋白为RFP、mRFP或mcherry蛋白。

进一步地，在步骤(1)中，肺巨噬细胞为THP-1、RAW264.7或U937细胞，肺上皮细胞为BEAS-2B、A549、NCI-H441或TC-1细胞。

进一步地，在步骤(1)中，肺巨噬细胞与肺上皮细胞的个数比为1:2-2:1。

进一步地，在步骤(1)中，细胞共混液中的细胞密度为2×10⁵-1×10⁷cells/mL。

进一步地，在步骤(1)中，聚阴离子聚电解质为海藻酸钠、透明质酸、琼脂、明胶和果胶中的一种或几种。

进一步地，在步骤(1)中，聚阴离子聚电解质的水溶液的浓度为1％w/v-1.5％w/v。

进一步地，在步骤(2)中，含二价金属离子的凝胶浴为含二价金属离子的氯化钠溶液，金属离子为钙离子、钡离子、镁离子和铁离子中的一种或几种。

在步骤(2)中，细胞共混液滴入凝胶浴后，二价金属离子能够螯合聚电解质中的阴离子，整个反应体系从溶液态转变为凝胶态，因而形成了载细胞凝胶微球，使用该方法，所形成的载细胞凝胶微球大小均一、粒径均匀、球形度高、形貌控制好。

在步骤(3)中，三维肺微组织模型为荧光蛋白标记的肺巨噬细胞与肺上皮细胞的三维细胞聚集体结构。

本发明还提供了一种采用上述方法所构建的三维肺微组织模型作为体外检测和评价肺自噬效应模型的应用。

进一步地，三维肺微组织模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)使用荧光蛋白分别标记LC-3的肺巨噬细胞与肺上皮细胞，然后均匀共混于聚阴离子聚电解质的水溶液中，得到细胞共混液；

(2)利用静电液滴法将步骤(1)得到的细胞共混液滴入含二价金属离子的凝胶浴中，形成载细胞凝胶微球；

(3)将步骤(2)得到的载细胞凝胶微球培养14-28天，得到三维肺微组织模型。

进一步地，应用时将待测物加入三维肺微组织模型中，定性或定量检测LC-3II在肺巨噬细胞与肺上皮细胞中的表达，以判定待测物引发的肺自噬效应类型。

进一步地，上述待测物为各种人体外源物质，如具有不同化学组成和理化性质的纳米粒、药物、环境污染物等。

进一步地，由于分别使用不同颜色的荧光标记了标记肺巨噬细胞与肺上皮细胞，因此在激光共聚焦显微镜下可观察到不同颜色荧光斑的分布和数目，对其进行定性或定量分析，判断待测物引发的是肺上皮细胞还是肺巨噬细胞的自噬流异常，并以此判定待测物引发的肺自噬效应类型。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：