[发明专利]一种高效提取核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高效提取核酸的方法。

背景技术

分子生物学是近年发展起来的生物学研究方法。分子生物学的第一步是核酸提取。

实践中，核酸提取方法主要有PC法(苯酚/氯仿)、提取试剂盒法等，提取试剂盒一般包括核酸放出试剂、蛋白等杂质清除试剂以及洗涤试剂、洗脱试剂组成，提取核酸需要三步或四步操作：即破细胞游离核酸、去除干扰物质和/或洗涤、洗脱核酸。但是，针对复杂样本，使用现有方法提取核酸核酸的获得率不高，提取后的核酸中影响PCR扩增的夹杂物过多，影响后续研究或诊断。

为了提高复杂样本的核酸提取效率，提高扩增效率，Qiagen等公司研发的粪便专用提取盒/土壤专用提取试剂盒等，但是，专用提取试剂盒通用性差，而且由于使用反渗透膜等技术，成本高昂，同时，专用提取试剂盒不能满足临床对特殊细菌的分子生物学检测-如艰难梭菌芽胞等检测需求。

为了解决上述问题亟需开发快速简便可靠的核酸提取方法和试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效提取核酸的方法，从而解决现有技术中存在的前述问题。

为了实现上述目的，本发明所述高效提取核酸的方法，所述方法包括：

S1，将待测样本和高硬度微球置于核酸抽出液中，进行震荡，得到初次处理液；

S2，提取初次处理液离心后的初次上清液，然后将初次上清液与酸性缓冲液混合，得到二次处理液；

S3，将二次处理液离心得到二次上清液，将二次上清液与具有破细胞和核酸吸附双重功能的缓冲液混合，离心后，去除上清液，得到沉淀；

S4，清洗所述沉淀，室温干燥后得到核酸；

所述核酸抽出液中包括50～1000mmol/L LiCl、50～250mmol/L Tris-HCl和SDS；所述SDS与所述核酸抽出液的重量体积比为0.5～2.5％；

所述酸性缓冲液包括醋酸钠、醋酸和蒸馏水，醋酸钠与所述酸性缓冲液的重量体积比为(0.5～5)g：100mL；醋酸与所述酸性缓冲液的体积比为(5～20)：100；所述酸性缓冲液pH值小于4；

所述含有破细胞-核酸吸附双重功能缓冲液包括4～8mol/L胍盐类和体积占比为50％的异丙醇。

优选地，步骤S1中，震荡的时间为30s～120s。

优选地，所述高硬度微球与所述待测样本的体积比为(0.5～1.0)：10；所述核酸抽出液与所述待测样本的体积比为(5～10)：10。

优选地，所述高硬度微球为氧化锆微球。

优选地，所述高硬度微球的直径为0.2mm～1.0mm。

本发明的有益效果是：

本发明的试剂中使用氧化锆进行细胞壁破坏，因氧化锆无磁性、无电导性、无表面功能基团且硬度极高，可以应用到离心柱法或磁珠法核酸提取的前处理，而不影响下一步的操作。将氧化锆微球和核酸提取液同时作用于样本，再以物理和化学方法作用在各种生物细胞或病毒/噬菌体外壁，达到提高提取效率的目的。本发明应用酸性缓冲液，比较彻底去除影响PCR扩增效率的杂质，提高扩增效率。本发明在沉淀核酸时应用破细胞-核酸吸附双重功能缓冲液，再次进行破细饱和吸附核酸，最大程度的保证了核酸获得率，为复杂样本的分子生物学研究提供高质量的核酸，以便于拓展提高分子生物学研究的应用范围，特别是为宏基因组研究提供了有力工具。本发明对痰液、粪便等复杂样本和芽胞等核酸提取困难的样本的核酸提取提供有力工具和新方法。

附图说明

图1是高效提取核酸的方法的流程示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

①关于高效提取核酸方法的说明

I、本发明所述方法是为复杂环境样本提出的核酸提取方法，以便于从复杂环境样本中提出用于分子诊断使用的核酸，所述复杂环境样本包括：土壤、粪便、污泥和包括食品和/或痰液和/或脓液的夹杂物。

本发明所述方法还能很简单的破碎芽孢等细菌特殊形态的坚硬细胞壁，高效提取核酸，所得到的核酸为样本中的全核酸，全核酸能够实现对样本的核酸检测或进行宏基因组分析。

II、本发明所述方法

步骤S1中，所述高硬度微球为无磁性、无电导性、无表面功能基团的高硬度微球；步骤S1将样本与高硬度微球加入核酸抽出液中后震荡的目的是：破碎细胞壁、芽孢外壁和真菌孢子。